PAX6 基因过表达促进大鼠骨髓内皮祖细胞向角膜内皮细胞分化

周梦 余菲 邵春益 傅瑶

角膜内皮是位于角膜和前房房水间的单层细胞结构，它的泵功能和屏障功能对维持角膜的透明起着至关重要的作用［1-2］。角膜内皮细胞在人体内维持终身无复制状态，当临床上的常见疾病如大泡性角膜病变、Fuch 角膜变性等使得细胞数量低于临界值时，会引起患者角膜水肿，严重时损伤视功能［3］。目前，此类疾病主要的治疗方法仍然是穿透性角膜移植手术或角膜内皮移植，但供体角膜的缺乏限制了移植手术的开展。在角膜替代组织缺乏的现状下，组织工程角膜受到了广泛的关注，种子细胞、生物相容性佳的载体、利于细胞生长的环境是组织工程角膜主要的三个因素，而在这其中，获得足够量的种子细胞是至关重要的一环。内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是一种来源于成人外周血和骨髓的干细胞，作为分化为成熟血管内皮细胞的中间状态，其在心血管疾病领域被广泛研究［4］。内皮祖细胞可在体外大量获得和增殖，是组织工程种子细胞的理想来源，近年来也被用于角膜组织工程研究［5］。PAX6 基因在正常的人眼球发育过程中具有非常重要的作用，参与细胞的增殖、迁移和分化等过程，与角膜细胞的功能密切相关［6］。本研究通过观察大鼠骨髓内皮祖细胞在转染PAX6 基因后向角膜内皮细胞转分化的过程，探讨其作为组织工程角膜种子细胞的可能性。

1 材料和方法

1.1 实验试剂和仪器

4 只雌性4 周龄SD 大鼠（上海交通大学医学院附属第九人民医院SPF 级动物中心）。本研究符合动物实验伦理原则。本研究中病毒转染部分由吉满生物科技（上海）有限公司进行。

EMG-2（Lonza 公司，瑞士），Histopaque（Sigma-Aldrich 公司，美国），纤连蛋白（BioSource 公司，美国），5% Donkey Serum（Jackson 公司，美国），CD31、CD34、CD133 一 抗（Santa Cruz 公 司，美 国），Dil-AcLDL（Invitrogen 公司，美国），FITC-UEA-1（Sigma-Aldrich 公司，美国），DAPI（Vector Labs 公司，美国），BCA 蛋白定量试剂盒（Thermo Scientific 公司，美国），5%脱脂牛奶（北京索莱宝科技有限公司），PAX6、GAPDH 一抗（武汉爱博泰克生物科技有限公司），mRNA 提取试剂盒（上海奕杉生物科技有限公司）。

台式大容量离心机（Eppendorf 公司，德国），细胞培养箱（Thermo Scientific 公司，美国），超纯水仪（Milli-Q Reference，美国），蛋白电泳仪（北京博泰斯生物技术有限公司），蛋白显影仪（上海天能科技有限公司），紫外／可见分光光度计（NanoDrop 公司，美国），PCR 仪（T3 thermeter 公司，美国），荧光正置显微镜（Olympus 公司，日本），制冰机（Scotsman，意大利）。

1.2 大鼠骨髓内皮祖细胞的分离和培养

取4 周龄雌性SD 大鼠，在无菌操作台中获取胫腓骨。用无菌1 mL 注射器抽取EMG-2 培养液冲洗两端关节的骨髓腔直至骨干变白，吸管吹打混匀后将用培养液稀释的骨髓腔细胞移至15 mL 离心管中，小心加入同体积的Histopaque（1.083 g／mL）密度梯度离心液，400×g、30 min、速度梯度模式离心。离心后的液体分为4 层，从上而下分别为培养液、磨砂色单核细胞层、透明Histopaque 液、红细胞层。用吸管小心伸入第二层磨砂色单核细胞层，尽可能将细胞吸尽，并置入新的50 mL 离心管中，加入同体积PBS 冲洗，之后250 g、10 min 离心后弃上清液，重复冲洗一次，尽量洗尽Histopaque 液。使用含10%FBS 的EGM-2 培养液重悬细胞，接种于纤连蛋白铺层的3.5 cm 培养皿，置入37 ℃、5%CO2培养箱中。第4 天全换液，之前保持细胞皿静置，换液时将未贴壁的细胞洗去，之后每两天观察细胞状态，细胞融合达80%时进行传代，传代比例为1 ∶3。

1.3 大鼠内皮祖细胞鉴定

将原代培养至第4 天的内皮祖细胞接种于铺有细胞爬片的24 孔板中，待细胞融合近80%时用4%多聚甲醛室温下固定细胞1 h，PBS 清洗3 遍后用含5% Donkey Serum 的PBS 室温下封闭1 h，PBS 清洗3 遍，用含2%体积的CD31、CD34、CD133 的封闭液（即一抗）在4 ℃环境下孵育过夜。PBS 清洗3 遍后使用相应的二抗室温下孵育1 h，荧光显微镜下观察、拍照。

取原代培养至第4 天的内皮祖细胞，吸出培养液，PBS 清洗细胞后加入含2 μL Dil-AcLDL 的200 μL细胞培养液，置于37 ℃培养箱孵育4 h。之后使用10%多聚甲醛室温下固定15 min，PBS 清洗2 遍，加入含2 μL FITC-UEA-1 的200 μL 培养液，置于培养箱孵育2 h。DAPI 染细胞核10 min，PBS清洗2 遍。荧光显微镜下观察，表达红绿蓝3 种荧光的为阳性细胞。

1.4 PAX6 基因的转染

取第一代状态良好的内皮祖细胞接种于3.5 cm培养皿中，待细胞融合近80%时进行病毒转染。装载GFP-PAX6（Ad-PAX6）的腺病毒作为实验组，空载组作为对照组（Ad-GFP）。吸出培养液后，用PBS 清洗2 遍，加入含0.01%（体积分数）病毒的细胞培养液进行病毒转染，6 h 后观察细胞形态，荧光显微镜下观察病毒转染效率。

1.5 免疫印迹实验（Western blot）

1.5.1 提取细胞蛋白质

以每3.5 cm 培养皿100 μL 的比例配制适量蛋白裂解液RIPA（含1%蛋白酶抑制剂），置于冰上预冷备用。从培养箱中取出待提取蛋白的细胞培养皿，吸去培养液，预冷的PBS 清洗2 遍，加入预冷的蛋白裂解液，使用蛋白刮沿皿底刮除1 遍，后置于冰上裂解10 min，重复2 次。超声波彻底裂解蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒定量蛋白浓度。

1.5.2 免疫印迹实验

以每孔25 μg 蛋白的浓度加样，选取12%的SDS-PAGE 胶，先设置80 V 进行电泳，待蛋白压成统一直线后加到120 V 电泳，直至跑出目的条带，转膜。室温下5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST 清洗3 遍至无封闭液残留，加入PAX6 和GAPDH 一抗4 ℃孵育过夜。TBST 清洗3 遍，加入种属相符的二抗室温下孵育1 h，TBST 清洗3 遍，蛋白显影仪上进行显影。

1.6 角膜内皮细胞特征性基因检测

1.6.1 提取细胞mRNA

全过程使用mRNA 提取试剂盒。从培养箱中取出待提取蛋白的细胞培养皿，吸去培养液，PBS 清洗2 遍。每孔加入500 μL 裂解缓冲液，置于冰上裂解5 min，加入500 μL 无水乙醇，吸管反复吹打后移入试剂盒中附有的提取柱中。12 000×g离心1 min，倒出废液，加入500 μL 洗涤液，清洗2 遍，加入20 μL洗脱缓冲液，12 000×g离心1 min 得到mRNA提取液。使用TaKaRa 试剂盒（宝日医生物技术有限公司）反转录mRNA 为cDNA，先测得mRNA 的浓度，根据浓度加入各种成分试剂，于机器中设置好反转录的3 个过程及温度时长，待过程结束后获得cDNA。

1.6.2 实时荧光定量PCR

Pubmed 基因库中设计AQP-1、ZO-1、ATP1A1、SNAI1、SNAI2 共5 种mRNA 的引物（AQP-1：ACCTGCT GGCCATTGACTAC，CCAGGGCACTCCCAATGAAT；ZO-1：CGCTAAAGGGAGGAAGTTGTGA，CCAGGTTG GAGGAAGCAGAAA；ATP1A1：AAGAACCCAAACGCA TCGGA，TTGCCGTGGAGGAGGATAGA；SNAI1：AGT TGTCTACCGACCTTGCG，TGCAGCTCGCTATAGTTGG G；SNAI2：CCTCATCTTTGGGGCGTGTA，ATGGCATG GGGGTCTGAAAG），使用转染空载组病毒的细胞作为对照组，转染PAX6 基因的细胞作为实验组，各组加入5 种目的基因的引物，并以GAPDH 引物作为内参进行校准。上机选择程序，得到原始循环数后使用ΔΔCt 值作图。

1.7 统计学分析

上述实验均重复3 次以上，每次实验均包含3个平行组。使用Prism 8 软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠内皮祖细胞的细胞形态和增殖情况

大鼠内皮祖细胞原代取材后接种细胞皿中12 h后即有细胞贴壁，形态为椭圆形，散落于皿底各处，有的细胞可形成放射状的生长形态。4 d 后，细胞克隆数增加，形态多呈短梭形，与周围纤维细胞形态形成明显差异。8 d 后，细胞密度增大，形态趋于椭圆形，开始形成相互间的连接，克隆直径明显增加。12 d 后，克隆直径进一步增大，细胞趋近铺路石样，形态饱满，相互之间紧密镶嵌。培养2 周后细胞可长满培养皿，此时可进行细胞传代，传代后的细胞形态与传代时的接种密度相关，密度过低会使得细胞纤维化（图1）。

图1 大鼠内皮祖细胞培养过程Fig.1 Culture process of rat endothelial progenitor cells

2.2 大鼠内皮祖细胞的鉴定

大鼠内皮祖细胞接种于培养皿第4 天，内皮祖细胞特异表达CD31、CD34、CD133。另外，Dil-AcLDL 染色呈红色，表明细胞可摄取AcLDL，FITCUEA-1 染色呈绿色，双染色阳性的细胞从功能学方面被认定为EPCs。结合上述结果可表明此种方法培养出的细胞为大鼠内皮祖细胞（图2）。

2.3 PAX6 基因的转染和基因表达情况

在荧光显微镜下观察转染后的内皮祖细胞，选取多个视野。无论在空载组还是过表达PAX6 组中，相差显微镜下所呈现的细胞基本呈现绿色荧光，表明细胞转染效率均达到95%以上。免疫印迹实验结果也与荧光染色结果一致，在过表达PAX6 组GAPDH 条带较浅的情况下（即过表达PAX6 组蛋白总量较少），空载组PAX6 蛋白几乎无表达。结果表明PAX6 成功转染大鼠骨髓内皮祖细胞（图3）。

2.4 角膜内皮细胞特征性基因检测

如图4 所示，AQP-1、ZO-1、ATP1A1 是3 种代表角膜内皮细胞屏障功能和泵功能的基因，这3 种基因在转染PAX6 基因的内皮祖细胞中表达均比空载组明显增多（P＜0.05），表明过表达PAX6 基因的骨髓内皮祖细胞有向角膜内皮细胞分化的趋势。SNAI1、SNAI2 是2 种纤维化相关的基因，内皮细胞对于此种结缔组织标志性基因呈低表达水平，这2种基因在转染PAX6 基因的内皮祖细胞中表达均比空载组明显减少（P＜0.05）。

图2 内皮祖细胞标志物荧光染色Fig.2 Fluorescence staining of endothelial progenitor cell markers

图3 内皮祖细胞转染PAX6 基因Fig.3 Endothelial progenitor cells transfected with PAX6 gene

图4 角膜内皮细胞标志物mRNA 表达水平Fig.4 mRNA expression level of corneal endothelial cell markers

3 讨论

人角膜内皮细胞在体内保持终生无复制状态，常见的大泡性角膜内皮病变及遗传性的Fuch 角膜营养不良会使得角膜内皮功能性失代偿，引起视力模糊乃至视力丧失，目前的最终治疗方案仍然是角膜移植［1-3］。近年来，角膜移植手术量虽然呈逐年增长趋势，但依旧受限于角膜供体不足。构建组织工程角膜为解决这一问题提供了新的可能性。

干细胞具有自我更新能力和多向分化的潜能，是组织工程种子细胞的理想选择。内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）由Asahara 等［7］于1997 年首次提出，作为血管内皮细胞的前体细胞，除参与胚胎组织的生成外，还代表一群可分化为多种组织内皮细胞的干细胞。EPCs 与造血干细胞共同起源于胚外中胚层，胎儿肝脏是脐血EPCs 最主要的来源，成人外周血和骨髓是成人体内EPCs的主要来源［8］。正常情况下，EPCs 数量较少，需要通过相应的筛选方法富集，常用的有密度梯度离心法和免疫磁珠法，本研究结合前期研究基础，采用成熟的密度梯度离心法培养大鼠内皮祖细胞。

内皮祖细胞的鉴定表型目前还存在诸多争议。单独从形态学上（形成短梭状或类铺路石样的细胞）鉴别缺乏坚实的证据，需辅以进一步的表型特征加以区别。CD34 为Asahara 等［7］首次分离外周血内皮祖细胞使用的特征分子，然而由于成熟的内皮细胞同样表达CD34，因此单独的CD34 阳性不具备特异性。Peichev 等［8］在CD34阳性细胞的基础上发现了CD133 的表型特异性，因为成熟的内皮细胞不表达CD133，因此可作为祖细胞的特征性分子。此外，Dil-AcLD 和FITC-UEA-1 表达双阳性可在功能学上被认定为内皮祖细胞［9］。本研究结合CD31、CD34、CD133、ac-LDL、UEA-1 染色来鉴定大鼠内皮祖细胞。结果表明，本研究中培养的细胞大量表达内皮祖细胞特异蛋白，可被认定为是大鼠内皮祖细胞。

PAX6 基因最初在研究WAGR 综合征时被发现。随后，Ton 等［10］在先天性无虹膜患者中发现此基因的缺失突变。之后大量的研究表明，PAX6 基因在正常的人眼球发育过程中起非常重要的作用，参与细胞的增殖、迁移和分化等过程，这些活动与角膜细胞的功能密切相关［11-13］。2014 年，Ouyang等［14］发现WNT7A 和PAX6 对角膜上皮细胞的活动至关重要。2020 年，Yu 等［15］通过研究发现角膜内皮细胞在损伤后PAX6 基因表达明显升高，并通过SUMO 化修饰调控其功能。因此，我们推测PAX6 基因对角膜内皮细胞的分化可能产生相应的影响。本研究证实，转染PAX6 基因的大鼠骨髓内皮祖细胞表达AQP-1、ZO-1、ATP1A1 等功能性基因，并下调纤维化基因的表达，呈现向角膜内皮细胞分化的趋势。

本研究通过培养骨髓内皮祖细胞，并使之过表达PAX6 基因，可诱导其向角膜内皮细胞分化，为组织工程角膜种子细胞体外来源不足提供了具有潜力的解决方案，也为角膜移植的进一步发展提供了新的可能性。