仿生修饰结合三维打印技术构建的胶原-聚己内酯支架可促进兔临界骨缺损修复

卢俊钦 杨鑫 李军 孙坚

骨是人体最易损伤的组织之一，因感染、创伤、肿瘤切除等导致的大块骨缺损的治疗仍是现代医学面临的难题［1］。自体骨移植作为治疗骨缺损的金标准，从19 世纪初至今一直被广泛运用于临床，然而自体骨移植是“以创治创”的模式，存在供区骨量不足和供区功能受损等并发症［2-3］。基于生物材料开发的骨移植替代物，克服了自体骨移植的缺点，有望广泛应用于骨缺损的治疗［4-5］。

目前，生物陶瓷、天然及人工聚合物等作为骨替代材料被运用于骨缺损治疗的研究或临床［4，6］。磷酸钙类陶瓷材料，如羟基磷灰石、β 磷酸三钙等，因具有与骨组织无机组分相近的特点和良好的生物相容性而被广泛运用，但其易脆、抗疲劳强度低、机械性能差，大多用于腔隙性骨缺损修复［4，7-8］。胶原（Collagen，Col）是一种天然聚合物，是机体组织中最主要的有机成分。基于胶原制备的生物材料，具有良好的生物可降解性和生物相容性，但是胶原支架材料机械性能较弱，目前大多用于皮肤、角膜以及腔隙性骨缺损等部位的修复。合成类聚合物，如聚己内酯（PCL）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）等，具有可控的机械性能和可生物降解的优势，已被广泛运用于骨组织工程材料的实验研究中［9-13］。目前，基于熔融成型三维打印技术制备的PCL 三维支架已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准，可运用于颅颌面部骨缺损修复治疗［4］。前期，本课题组利用三维打印技术（Three dimensional printing）制备出三维多孔PCL 支架，该PCL 支架具有可控的孔径结构和完全空隙连通率，并可根据需要制备出个体化骨替代移植物［14］。然而，单一PCL 支架具有较强的表面疏水性能和生物惰性，导致体外细胞黏附能力差，植入体内后存在纤维组织包绕和组织整合不良等问题［12，15］。

为了克服单一材料的缺点，最大限度地发挥各类材料的优势，本研究拟构建一种可降解仿生复合材料Col-PCL。利用三维打印技术制备出基于骨缺损的骨充填PCL 支架材料，在三维多孔PCL 支架表面及内部，利用胶原模拟自然骨组织的细胞外基质（ECM）进行仿生修饰，以提高支架材料的生物活性；而PCL 则作为“骨架”为多孔胶原基质提供力学支撑。通过体外及体内试验验证该支架材料的生物活性及成骨活性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

12 只6 月龄雄性新西兰大白兔、6 只28 天龄胎兔均购自上海甲干生物科技有限公司。本研究中的相关动物实验得到上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会批准（SH9H-2019-A514-1）。

PCL（相对分子质量850 000，深圳光华伟业股份有限公司），猪皮胶原（四川铭让生物科技有限公司），EDC（Sigma 公司，美国），CCK-8（日本株式会社同仁化学研究所），细胞LIVE／DEAD 染色剂（Thermo Fisher 公司，美国）。

三维打印熔融成型机（HTS MAM-ⅡFree From Fabrication，富奇凡机电科技有限公司），场发射扫描电子显微镜（S-4800，Hitachi 公司，日本），万能测试机（Instron 5542，美国），倒置相差显微镜（莱卡，德国），激光共聚焦显微镜（莱卡，德国），Micro-CT（GE eXplore Locus SP Micro-CT，美国）。

1.2 三维打印PCL 支架材料

将PCL 原料装入三维打印熔融成型机的熔化器中，加热至120 ℃，维持温度，使PCL 融化成半流态，在计算机控制下按stl.文件模块的形状，由直径为500 μm 喷嘴沿X、Y轴在特定的位置挤出，降温至常态后凝固，然后沿Z轴上升一个高度再重复X、Y轴的运动，喷嘴中再挤出半流态PCL，降温凝固时与下一层紧密粘结，如此一层层堆积制作支架，制备出骨缺损植入PCL 支架。

1.3 PCL 支架材料的仿生修饰

将三维打印的PCL 支架材料置入5 mol／L 的NaOH 溶液中2 h，进行表面活化。取出后以双蒸水清洗至pH＝7.4，无菌橱晾干备用。配制10 mg／mL的猪皮胶原溶液。将表面活化后干燥的PCL 支架浸入10 mg／mL 胶原溶液中，真空抽吸30 min，去除气泡，缓慢释放至正常大气压。PCL 支架完全浸没在胶原凝胶中，使胶原凝胶完全充填在PCL 支架孔径内部。无菌镊子夹持，将胶原充填后的PCL 支架取出，轻放于无菌培养皿中，-20 ℃冷冻24 h，-50 ℃冷冻干燥48 h，得到冻干的Col-PCL 支架。将上述Col-PCL 支架置入50 mmol／L 的EDC 交联剂中常温交联24 h，无菌双蒸水超声振荡清洗3 次，冷冻干燥，获得本实验所需Col-PCL 支架材料［16］。

1.4 Col-PCL 支架材料表征

将材料切成5 mm×5 mm×3 mm 大小，75%乙醇超声振荡清洗3 遍，双蒸水超声振荡清洗3 遍，冷冻干燥24 h，干燥无菌条件下保存。进行场发射扫描电子显微镜（FESEM）观测前，在10 mA 电流下喷金20 s，在10 kV 电压下对PCL 三维支架进行三维结构的观测，对PCL 和Col-PCL 支架材料的孔径进行测量，依据表观密度法测量PCL 和Col-PCL 支架的孔隙率［17］。

1.5 机械性能检测

支架材料的力学性能采用抗压强度和抗压模量来进行检测。实验在万能测试机Instron 5542 上进行，支架压缩实验样品为圆盘型，直径10 mm，高为3 mm，实验时沿支架材料的Z轴施压，压缩速率为1 mm／min，最大压力为500 N，当形变量达到80%时停止压缩，最后样品压缩模量经由压缩应力-应变曲线的线性区斜率获得，每组有5 个实验样品，实验结果取平均值［18］。

1.6 体外细胞活性检测

取28 天龄幼兔的双侧股骨，剪断干垢端，用生理盐水冲洗骨髓腔内细胞至培养皿，静置培养4 d，去掉上清及悬浮细胞，可见贴壁生长的细胞，为兔骨髓间充质干细胞（Rabbit bone marrow stromal cells，r-BMSCs），继续细胞培养，至细胞生长至80%后传代，取第三代r-BMSCs 用于后续实验。

将材料切成5 mm×5 mm×3 mm 大小用于检测体外细胞活性，消毒后置于24 孔板中，将第三代r-BMSCs 悬液以3×104个（25 μL）的密度接种到支架材料上，孵育1 h 后，将同样的细胞悬液以相同的密度接种于支架的另一面，再次孵育1 h，加入1 mL 培养基培养。分别在接种1、3、7 d 将支架转入96 孔板中，加入CCK-8 工作液110 μL（100 μL D10 加入10 μL CCK-8 储存液）孵育2 h，酶标仪在450 nm波长下检测光密度，以评价细胞在支架材料上的增殖活性［19］。每天在倒置相差显微镜下观察接种细胞后的支架材料。于细胞接种后7 d 取出支架材料，PBS 清洗3 遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3 遍，细胞LIVE／DEAD 染色剂染色10 min，PBS 清洗3 遍后，激光共聚焦显微镜下观察细胞形貌及细胞活性。

1.7 体内骨缺损治疗研究

12 只6 月龄雄性新西兰大白，随机分成2 组：PCL 组（n＝6）和Col-PCL 组（n＝6）。麻醉后，消毒左前肢，以尺桡骨中点为中心做纵行切口，长约20 mm，逐层切开皮肤、筋膜及肌层，显露左侧尺桡骨中段，牙钻制备出15 mm 桡骨中段缺损。Col-PCL组植入Col-PCL 支架材料，PCL 组植入PCL 支架材料。手术结束后，生理盐水冲洗，止血后对位分层缝合，术后给予抗生素肌内注射3 d。术后12 周过量麻醉处死动物，取出术侧桡骨及尺骨，4%甲醛固定1 周。将目标骨组织修整后进行Micro-CT 扫描，用Micro-CT 自带软件进行图像数据采集及三维重建，计算新生成骨量；同时进行HE 和Manson 染色，显微镜下观察。

1.8 统计学分析

所有数据均用¯x±s表示。数据组间差异统计采用SPSS 18.0 的单因素方差分析，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 支架材料表征

如图1 所示，PCL 支架材料垂直孔洞呈三角形，孔隙相互连通，碱处理法表面活化后，PCL 支架的大体形态和结构并未引起任何改变，碱活化处理使PCL 支架表面变得更加粗糙。胶原仿生修饰后，多孔胶原呈海绵状均匀充填在PCL 支架的孔洞之间，三维打印PCL 的大孔结构消失。场发射扫描电子显微镜（FESEM）观察显示，PCL 支架表面可见碱腐蚀的粗糙表面，但支架孔径大小均匀，孔径大小约（405±8.4）μm，胶原修饰活化后，多孔胶原支架填充到PCL 大孔中间，胶原具有多孔结构，孔径大小均匀，多孔的胶原呈网状充填在PCL 支架水平孔洞内部并包绕支架的梁，形成大小约100 μm 的孔径。表观密度法测量显示，PCL 支架孔隙率为67.4%±1.8%，Col-PCL 孔隙率为65.9%±1.5%，修饰后的支架空隙率有所下降，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）。机械性能测试表明，PCL、Col-PCL 分别具有（42.40±4.92）MPa、（53.42 ±6.22）MPa 的抗压模量，差异显著（P＜0.05）。

2.2 评估细胞黏附和增殖

图1 PCL、Col-PCL 支架大体观察及场发射扫描电子显微镜观察Fig.1 General observation and FESEM observation of PCL and Col-PCL scaffolds

r-BMSCs 接种到支架材料上7 d，倒置相差显微镜观察发现，PCL 支架及Col-PCL 支架材料均有细胞增殖和生长。利用LIVE／DEAD 染色剂对支架材料上的细胞进行死活染色，共聚焦显微镜观察发现，接种后7 d，在PCL 及复合支架材料Col-PCL 上均有活细胞生长，细胞呈圆形或卵圆形，细胞分布均匀，细胞主要分布在多孔胶原网络表面；与PCL 组相比较，Col-PCL 支架组展现出了更多的初始细胞量，这与Col-PCL 具有较高的接种效率有关。细胞增殖实验结果表明，接种后1、3、7 d，复合支架材料组细胞数量明显较PCL 支架组多，且随时间延长对比越来越明显，说明细胞在Col-PCL 支架材料上增殖活性更高，这与Col-PCL 支架材料能提供更多的增殖空间有关（图2）。

2.3 兔桡骨临界骨缺损修复

如图3 所示，顺利制备15 mm 新西兰大白兔桡骨中段缺损，并植入对应支架材料（PCL、Col-PCL），术后所有动物均未出现术区感染等症状。

图4 表明，利用Micro-CT 对新生骨量进行分析评估发现，PCL 组没有明显的新生骨组织形成，只有在骨断端两端有散在少量骨组织新生和长入；Col-PCL组的三维重建图像中，可见新生骨组织实现了骨断端的连接，同时在骨缺损区有皮质骨形成，将支架材料包绕骨组织内部。对新生骨量进行统计分析发现，Col-PCL 组新生骨组织体积明显较PCL组多，Col-PCL 有（95.49±11.13）mm3的新生骨量，PCL 只有（30.78 ± 8.94）mm3的新生骨量，差异显著（P＜0.05），新生骨量／组织缺损（BV／TV）也差异显著（P＜0.05）。

图2 体外评估细胞在支架材料上的黏附和增殖Fig.2 In vitro evaluation of the cell adhesion and cell proliferation on the scaffolds

图3 兔桡骨临界骨缺损修复实验Fig.3 The critical bone defect experiment of rabbit radius

图4 Micro-CT 评价支架材料修复兔桡骨临界骨缺损Fig.4 Micro-CT evaluation of the bone defect treatment in the critical bone defect experiment of rabbit radius

组织学分析时，采用平行于桡骨长轴的纵向切片方式。HE 染色发现，PCL 组骨缺损区被染成淡红色的疏松纤维结缔组织充填占据，同时纤维组织紧紧包裹覆盖在PCL 横梁周围；这一结果在Manson 染色中同样被证实，淡蓝色的纤维组织包绕支架周围，在支架与骨断面的连接处，形成致密的纤维界面。在Col-PCL 组中，骨缺损区主要由新生骨组织充填，Masson 染色发现骨缺损区的新生骨组织中有成熟（暗红色）的和不成熟（浅蓝色）的骨组织，新生的骨组织直接与支架材料结合，通过支架材料与骨断端处的原始骨组织相连接；同时在Col-PCL 组中，新骨生成的中央可见到骨髓样组织形成，说明新生骨组织在逐渐成熟并与正常骨组织有同样的结构和功能（图5）。

图5 组织学评估Fig.5 Histological evaluation

3 讨论

骨组织工程支架材料不仅应具有多孔结构和优良的生物相容性，同时还应具有局部骨传导性及合适的机械强度。适当机械稳定性是指支架材料应具有与自体骨相近或相匹配的机械强度，以抵抗机体压力、稳定局部成骨微环境，直到新生骨组织具有力学支撑功能［20］。之前的研究证实，机械强度更高的材料可促进间充质干细胞向成骨细胞方向分化，促进软骨内成骨［21-22］。该结果提示，开发一种具有与自体骨机械性能相近的支架材料将会有利于骨组织的再生。

PCL 具有熔点低（63 ℃）、易于加工等特点，已被广泛运用于制备组织工程支架材料［11，23-24］。本研究利用三维打印制备多孔PCL 作为支撑骨架材料，以承载机体重力和抵抗局部组织的收缩力。本研究中，机械性能测试表明，PCL、Col-PCL 分别具有（42.40±4.92）MPa 和（53.42±6.22）MPa 的抗压模量，在一定程度上能满足硬组织修复的力学支持需要（10～1 500 MPa）［25］。兔桡骨临界节段性骨缺损植入实验结果也表明，三维打印的PCL 支架材料及Col-PCL 支架可以承载局部骨组织再生所需的力学支撑。

除了考虑机械性能以外，支架材料生物学性能也非常重要。之前的研究表明，单独使用人工合成聚合物支架材料可导致纤维组织的包裹，从而削弱组织再生能力导致组织再生不足［4］。碱表面处理法可提高聚合物支架表面粗糙度，减少成纤维细胞黏附的密度，而成纤维细胞是合成胶原和形成纤维包裹的最主要细胞，与之前研究结果一致［4，26-27］。本实验中，碱活化处理后PCL 支架表面变得更加粗糙，使得PCL 支架材料具有较好的亲水性能和吸水性能，更有利于细胞黏附、增殖以及营养物质转运［18］。然而体内试验证实，碱处理表面活化后的PCL 支架仍有大量的纤维组织浸润和包裹，基本没有新骨形成，不能实现临界骨缺损的修复，这说明单纯靠碱处理表面活化并不足以改善和提高PCL 的生物活性。

为了提高PCL 支架生物活性，有研究尝试在PCL 支架中混入磷酸钙类生物陶瓷颗粒，但存在材料混合不均、成型后大部分无机材料颗粒被聚合物包裹而不能显露于材料表面等缺点［28-30］。亦有研究尝试利用静电丝仿、熔融成型法及表面Col 涂层等方法制作Col-PCL 复合支架，以提高PCL 支架活性［11-12，31］。体外研究表明，这些方法均可一定程度上提高PCL 的生物活性，但都缺乏进一步的体内试验研究结果。本研究中，为了最大限度复合胶原从而最大程度提高PCL 活性，我们设计了大孔径的PCL 支架材料，这一支架材料具有多孔结构和完全的孔隙连通率。经过胶原三维活化后的PCL 支架材料提高了细胞接种效率，细胞均匀分布于支架表面。这是因为胶原修饰后的支架具有更大的表面积，提供了更多的细胞黏附位点，可富集更多的内源性细胞，从而促进缺损区域的骨修复［31］。另外，三维网状胶原支架作为空间填充材料，均匀分布在PCL 表面和支架孔隙中，起到了临时屏障和空间占据作用，阻止早期纤维组织的浸润，降解后可为新骨形成提供空间，在三维空间上起到膜引导骨再生的作用。

支架材料植入兔桡骨临界骨缺损12 周后，能实现兔桡骨1.5 cm 临界骨组织缺损的修复。相对于PCL组，Col-PCL 组具有约3.1 倍［（95.49±11.13）mm3vs.（30.78±8.94）mm3］的新骨生成能力。这一结果表明，Col-PCL较PCL 支架具有较好的骨形成能力，一方面与支架材料具有较好的细胞黏附能力有关，另一方面仿生矿化的胶原基质分布于大孔PCL 之间，提供了一个三维屏障，起到临时充填和阻隔作用，以防止支架植入早期纤维组织的长入，为新骨的长入提供了空间，起到了膜引导骨组织再生的作用［32-33］。所有这些因素都促进了支架材料的骨修复能力和骨整合能力，使得Col-PCL 支架材料在12周内实现对兔桡骨临界骨缺损的修复。

4 结论

本研究利用仿生功能化支架材料Col-PCL 对兔桡骨临界骨缺损进行修复，以验证支架材料的骨修复能力。支架材料植入兔桡骨临界骨缺损12 周后，经影像学和组织学分析发现，Col-PCL 支架具有良好的骨诱导性和骨传导性以及极好的骨整合能力，能在12 周内实现对兔桡骨临界骨缺损的修复，该支架作为一种骨缺损治疗的骨移植替代品，具有一定的研究和应用前景。