软骨脱细胞基质仿生支架的制备及其对骨髓基质干细胞成软骨分化的影响

张沛灵 慈政 贾立涛 刘豫 曹谊林 周广东

软骨缺损是临床常见的疾病之一。由于缺乏血管与神经，软骨组织一旦受损便很难进行自我修复［1-2］。目前的治疗手段主要包括软骨成形术、自体软骨细胞移植、自体软骨组织移植等，但均有其局限性［3］。组织工程技术为临床软骨修复提供了新的途径和更广阔的应用前景［4-5］。组织工程研究主要包括三个方面：种子细胞、支架材料和生长因子。其中，数量充足的种子细胞是组织再生的物质基础，支架材料可以提供适宜的生理微环境，对体外构建软骨具有关键作用。

近年来，来源于各种组织和器官的脱细胞基质支架越来越受到重视，被用于各种类型受损组织和器官的修复与再生［6-8］。软骨脱细胞基质（Acellular cartilage matrix，ACM）具有天然的促软骨形成微环境，是最理想的软骨组织工程支架材料。骨髓基质干细胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）具有软骨定向分化潜能，是一种理想的种子细胞来源。

本研究将脱细胞处理后的软骨组织粉末以不同比例与明胶（Gelatin，GT）溶液混合并交联，制成多孔仿生三维支架。接种山羊BMSCs 后体外短期诱导，观察细胞在支架上的黏附、分布与基质分泌情况，并评估BMSCs 的成软骨分化能力，为ACM 支架复合BMSCs 体外再生软骨的研究和临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂、仪器与动物

DNase、RNase、抑肽酶、Tris-HCl、Triton X-100、明胶、EDC、NHS（Sigma，美国）；低糖DMEM 培养基、0.25%胰蛋白酶、青霉素-链霉素-两性霉素B（Gibco，美国）；胎牛血清、PBS（Hyclone，美国）；DNA 定量试剂盒（Invitrogen，美国）；DAPI（武汉赛维尔生物科技有限公司）。

荧光显微镜（Leica，德国）；扫描电镜（Philips XL-30，荷兰）；力学分析仪（Instron，美国）；真空冷冻干燥机（上海亿倍实业发展有限公司）；全自动冷冻研磨仪（上海净信实业发展有限公司）。

6 月龄山羊1 只（上海甲干生物科技有限公司）。所有动物实验方案均经过上海交通大学医学院动物实验管理委员会批准。

1.2 软骨脱细胞基质的制备

新鲜的牛肩胛软骨在去除表面多余筋膜与结缔组织后浸入液氮中5 min，冷冻研磨仪将软骨组织研磨成细粉末，留取部分软骨片用于验证脱细胞效率。随后进行脱细胞处理：0.5%（w／V）胰蛋白酶／PBS溶液在37 ℃中持续振荡24 h，每4 h 更换新鲜的胰蛋白酶溶液。PBS 洗涤，核酸酶溶液（50 U／mL DNase、1 U／mL RNase 溶于10 mmol／L Tris-HCl，pH＝7.5）37 ℃振荡4 h。10 mmol／L Tris-HCl 溶液（含10 U／mL抑肽酶）37 ℃振荡20 h。1%（v／V）Triton X-100／PBS 37 ℃振荡24 h。PBS 洗涤6 个循环，每次2 h。离心后将沉淀冷冻干燥制成ACM 粉末。

1.3 软骨脱细胞效率的评估

1.3.1 组织学评估

将未脱细胞的天然软骨与脱细胞处理后的软骨片以4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，5 μm 切片，行HE 染色。

1.3.2 细胞核荧光染色

将未脱细胞与脱细胞的软骨片以4%多聚甲醛于室温下固定，PBS 洗涤3 次。加入少量DAPI 染液，用量以覆盖软骨片表面为准，室温下染色5 min。吸除DAPI 染液，PBS 洗涤3 次，每次5 min。置于荧光显微镜下观察细胞核染色情况。

1.3.3 DNA 定量检测

使用DNA 定量试剂盒，按操作说明荧光酶标仪检测未脱细胞与脱细胞处理后软骨的DNA 含量。

1.4 不同比例ACM／GT 支架的制备

GT 用去离子水在37 ℃中振荡溶解，配成0.8%的GT 溶液，并按一定比例加入ACM 粉末（表1），混匀后冷冻干燥处理，EDC-NHS 交联，制成直径8 mm、厚度2 mm 的圆柱状支架，环氧乙烷消毒备用。

1.5 不同比例ACM／GT 支架的表征分析

1.5.1 孔径大小评估

SEM 观察并拍摄各组支架材料的表面微观结构，每组平行测量3 个样本。Image-J 软件分析图片，选取不同视野的50 个孔隙测量各组孔径。

1.5.2 孔隙率评估

一定体积的无水乙醇装入一带有刻度的试管，将支架材料浸入无水乙醇中，2 h 后记录刻度变化为V1，取出支架材料后记录刻度变化为V2，孔隙率＝（V2-V1）／V2×100%，每组平行测量3 个样本。

1.5.3 生物力学评估

将支架材料置于力学分析仪上，沿垂直方向以0.5 mm／min 的速度向样本施压，直至样本破碎。根据力-位移曲线计算得出各组的杨氏模量，每组平行测量3 个样本。

1.5.4 降解速率评估

称量并记录各组样本的初始重量M0，然后将样本置于PBS 中37 ℃恒温孵育，第1、7、14、28 天取出样本用去离子水彻底浸泡洗涤，冷冻干燥后称量并记录m1。计算各组样本在不同时间点的质量损失，质量损失率＝（m0-m1）×100%，每组平行测量3个样本。

1.6 细胞的获取与细胞支架复合物的制备

无菌条件下抽取山羊髂前上棘骨髓血15～20 mL，等体积比加入含10% 胎牛血清的低糖DMEM，1 500 r／min 离心5 min，吸除上层脂肪层。按每皿2 mL 骨髓血接种于10 cm 培养皿中，第5 天细胞贴壁后全量换液，随后扩增并传代，取第二代BMSCs 备用。

将第二代山羊BMSCs 制成6×107个／mL 的细胞悬液，均匀接种在消毒过的支架材料上，37 ℃、5%CO2环境下孵育4 h，后加入成软骨诱导培养基（含10 ng／mL 转化生长因子β1，40 ng／mL 地塞米松，100 ng／ml 胰岛素样生长因子-1 等；无血清）体外培养。第1、7、14 天SEM 观察细胞在支架内的黏附、分布与基质分泌情况。

1.7 成软骨分化能力评估

收集体外培养14 d 后的各组样本，按试剂盒说明书提取样本RNA，并行反转录PCR 分析。检测成软骨相关基因ACAN、COLⅡA1、Sox9，β-actin 设为内参（表2）。

1.8 统计学分析

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，组间比较采用t检验及单因素方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

表2 PCR 引物序列Table 2 PCR primer sequence

2 结果

2.1 软骨脱细胞效率的评估

未脱细胞的天然软骨HE 染色可见深蓝色软骨细胞核；ACM 则可见软骨陷窝内无细胞（图1A、B）。未脱细胞天然软骨在DAPI 染色后经荧光激发可见散在发蓝光的软骨细胞核；ACM 在DAPI染色后荧光激发未见细胞核（图1C、D）。DNA 定量数据显示经脱细胞处理后DNA 含量与天然软骨相比下降了90%（图1E）。这些结果显示软骨细胞已被脱尽。

图1 脱细胞效率的评估Fig.1 Evaluation of decellularization process

2.2 不同比例ACM／GT 支架的表征分析

各组ACM／GT 支架直径约8 mm，厚度约2 mm，大体外观无明显差异。SEM 显示各组孔径分布较为均匀，孔径大小有所差异（图2）。

图3 不同混合比例ACM／GT 支架的表征分析Fig.3 Characteristics of ACM／GT scaffolds with different proportions

G1A2 较单纯明胶孔径有所减小，随着ACM 比例的增加，孔径逐渐增大。G2A2 孔径与单纯明胶相近，分别为（249±21）μm 和（251±22）μm（图3 A）。除G1A2 孔隙率有所上升外，其余组孔隙率无明显差异，均在85%以上，适合软骨生长（图3B）。同时，随着ACM 比例增加，支架材料的力学强度逐渐减小（图3C）。各组支架在第1 天时质量损失均在10%以下，之后随着ACM 比例的增加，降解速率增快，其中G1A2 在第14 天时支架已经破碎，无法维持固定形态（图3D）。

各组不同比例ACM／GT 中，G2A2 的孔径、孔隙率、力学强度、降解速率均适宜软骨体外再生，因此选取G2A2 进行体外构建再生软骨。

2.3 支架材料的生物相容性

SEM 结果显示，第1 天时细胞呈球状黏附在支架材料表面，同时伴随有少量的基质分泌；第7 天时细胞进一步铺展，均匀分布在支架表面，基质分泌进一步增加；第14 天时，细胞基质已将材料表面完全覆盖。同时，G2A2 组较单纯明胶有更为丰富的基质分泌（图4）。

图4 细胞-支架复合物的大体观及扫描电镜观察Fig.4 Gross view and SEM observation of cell-scaffold constructs

2.4 ACM／GT 支架对BMSCs 成软骨分化的影响

使用qRT-PCR 对BMSCs 成软骨分化相关基因进行检测。结果显示，与单纯明胶相比，G2A2 的ACAN、COLⅡA1、Sox9 的mRNA 表达水平均有显著上调，显示了ACM 的存在促进了BMSCs 的成软骨分化（图5）。

图5 成软骨相关基因的表达Fig.5 Expression of chondrogenesis related genes

3 讨论

外伤、炎症、衰老所造成的软骨损伤一直是临床上非常棘手的难题。为了有效地修复软骨损伤，缺损的区域需要填充一定体积与力学强度的修复组织［9］。软骨组织工程技术可以在体外构建各方面与天然组织相似的再生组织，为临床治疗软骨缺损提供了新的途径［10］。种子细胞和支架材料是组织工程技术的重要组成部分，为良好的修复效果提供了物质基础。

目前用于软骨组织工程的种子细胞来源主要是软骨细胞和具有软骨定向分化潜能的干细胞，如BMSCs 等。由于软骨细胞自体来源有限，且取材较为困难，无法获取足够数量的活性细胞，临床应用受限［11-12］。BMSCs 获取途径方便，且细胞增殖速度快。以往研究已经证实BMSCs 在关节软骨微环境的调节下可以修复软骨缺损［13］。因此，本研究选取山羊BMSCs 作为种子细胞来源。

支架材料也是组织工程另一个具有关键作用的组成部分。理想的支架材料需要满足以下要求：①具有三维多孔结构及合适的孔径、孔隙率以供细胞生长；②一定强度的力学支撑以维持再生组织的形态；③合适的降解速率，在保持再生组织三维形态的条件下减少进入体内后的炎症反应；④良好的生物相容性；⑤与天然组织相似的仿生微环境。常用于组织工程再生修复的支架材料主要包括人工合成材料和天然可降解材料。人工合成材料，如PGA、PLA、PLGA 等，其降解产物具有一定的细胞毒性，不利于细胞活性维持和组织的良好再生。天然可降解材料具有良好的生物相容性，有利于细胞的黏附与增殖［14］。近年来，组织工程领域出现了一种新的趋势，即将脱细胞基质作为组织再生的支架材料。各种类型的脱细胞基质可以为细胞提供独特的天然微环境，以帮助干细胞的分化和组织再生［15］。但由于软骨组织较为致密，直接将大块软骨进行脱细胞处理很难达到理想的脱细胞效果，而残留的细胞成分会引起强烈的免疫反应，因此通常将软骨粉碎至粉末状以提升软骨组织的脱细胞效率［16-17］。而单独应用ACM 粉末很难将其塑形为具有一定三维立体形状的支架材料，因此本研究混合了一定比例的GT溶液以提升ACM 的交联性能，经冷冻干燥成功制备出了具有圆柱状三维形态的ACM／GT 多孔仿生支架。结果显示，不同混合比例的ACM／GT 支架在孔径、孔隙率、力学强度、降解速率等方面均有所差异，因此选取各方面参数最适宜软骨再生的G2A2 进行体外构建再生软骨。有研究表明，脱细胞软骨片复合自体BMSCs 可以有效修复关节软骨缺损［18］。然而，粉碎后的ACM 粉末是否仍然保留BMSCs 的软骨定向诱导作用犹未可知。

本研究将G2A2 支架与山羊BMSCs 复合，体外成软骨诱导14 d。SEM 显示细胞在支架上逐渐铺展、增殖，基质分泌逐渐增多，支架的生物相容性良好。qRT-PCR 显示，G2A2 上调了BMSCs 成软骨相关基因的表达，促进了BMSCs 的成软骨分化。对于ACM 促进软骨形成的机制，目前知之甚少。所提出的假设主要有：①ACM 对细胞形态的影响；②ACM中残留的生长因子；③ACM 的天然微观结构；④ACM中生化成分（糖胺聚糖和胶原）的影响［19］。

综上所述，ACM 可以制成适宜软骨再生的三维多孔仿生支架，且能有效诱导BMSCs 的成软骨分化，是一种理想的软骨组织工程支架材料，为进一步的临床应用提供了依据。