炎症微环境作用下BMPs-ERK5 信号通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响

雷晓旭 王春 赵曦

牙周膜干细胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是牙周组织再生修复的重要种子细胞［1］。相关研究表明，牙周组织再生修复能力在慢性牙周炎的侵袭作用下可明显降低。目前，修复牙周炎导致的牙周组织损伤的研究主要围绕如何促进牙槽骨再生［2］。骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）对干细胞成骨分化具有诱导作用，其较为突出的亚型主要是BMP2、BMP7 和BMP9。李静等［3］的研究显示，BMP2、BMP7 和BMP9 的表达可介导永生化成牙本质细胞（Immortalized odontoblasts，iODs）成骨分化。与BMP7 比，BMP2 和BMP9 介导iOD 的成骨分化作用更强。进一步的研究表明，BMPs 诱导干细胞成骨分化的机制与激活丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-actibated protein kinases，MAPKs）通路相关［4］，MAPKs 中的细胞外信号调节激酶5（Extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5）在血管生成和细胞分化方面均具有一定的作用［5］。Tsioumpekou 等［6］研究证实，ERK5 影响基因表达的机制在于被激活的ERK5 可介导BMPs 的释放和／或活化，即形成BMPs-ERK5 信号通路。在炎症微环境作用下，原代人牙周膜干细胞（Human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）的骨分化能力降低，牙周组织再生修复能力降低，BMPs-ERK5信号通路是否参与这个病理过程，目前鲜有研究报道。本文旨在探讨炎症微环境作用下BMPs-ERK5信号通路对hPDLSCs 成骨分化的影响，为牙槽骨再生的研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

离体牙样本源自因治疗需要拔除的健康以及慢性牙周炎的病例样本。于慢性牙周炎患者获取炎症牙周膜组织，于因正畸需要拔除健康牙的患者获取正常牙周膜组织。采用Armitage 推荐的慢性牙周炎诊断标准［7］。纳入标准：①X 线片显示牙槽骨吸收超过2／3；②没有吸烟史；③近6 个月没有服用特殊药物；④所有组织样本均来源于本院口腔科；⑤所有患者已签署知情同意书。本实验已经医院伦理委员会审批通过。

腺病毒载体Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9、绿色荧光蛋白腺病毒载体（Ad-green fluorescent protein，Ad-GFP）均购自美国芝加哥大学分子肿瘤研究室；p-ERK5 抗体（CST 公司，美国）；BMPs-ERK5 信号通路特异性抑制剂BIXO2189（Selleck 公司，美国）；Ⅰ型胶原酶、维生素C、β-磷酸甘油（Sigma 公司，美国）；DMEM／F12 培养基（HyClone公司，美国）；角蛋白抗体、波形蛋白抗体和荧光兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；胎牛血清（Gibco 公司，美国）；碱性磷酸酶（Alkaline phosphorylase，ALP）活性检测试剂盒、ALP 显色试剂盒、Western blot 试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；茜素红染液（Solarbio 公司，美国）；qRT-PCR 试剂盒（天根生化科技有限公司）。

1.2 分离、培养hPDLSCs

准备已预冷并含有双抗的DMEM／F12 培养基，将上述牙齿拔除后立即放入其中，确认牙周膜组织附着完整后立即转入实验室生物安全柜中，使用2×的生理盐水对牙根进行反复冲洗，手术刀刮取根中1／3 牙周膜组织置于1.5 mL 的离心管中，并加入1 mL Ⅰ型胶原酶，37 ℃水浴30 min，每隔5 min 振荡1 次。加入1 mL 含10%FBS 的DMEM／F12 培养液，1 200 r／min 离心，弃上清，处理后的样本移入铺有一层血清的细胞培养瓶中，加入3 mL DMEM／F12完全培养液并倒置存放，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中，第2 天翻转正置继续培养，待细胞爬出组织块，72 h 更换一次培养液，细胞融合达80%～90%时进行消化传代。

1.3 应用细胞免疫荧光染色鉴定hPDLSCs

于24 孔板内接种第3 代hPDLSCs，当细胞达到80%融合时以PBS 清洗，5 min／次，清洗3 次，在培养箱中培养15 min（0.1% TRriton-100），1%BSA 封闭5 h，滴加抗波形蛋白，4 ℃孵育12 h，PBS 清洗后加入兔二抗，37 ℃孵育60 min，使用DIPA 染核5 min，纯净水终止，抗粹灭剂封片，激光共聚焦显微镜下观察。

1.4 细胞克隆形成

取第3 代hPDLSCs 消化，将400 个细胞接种于培养皿中，置于培养箱中培养，1 个克隆形成单位以50 个细胞为准，观察细胞的生长情况，10～14 d 后取出培养皿，4%多聚甲醛固定30 min，漂洗3 次，染色30 min，PBS 漂洗终止，倒置显微镜下拍照并观察。

1.5 ALP 染色及ALP 活性检测

将Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-BMP7 和Ad-BMP9蛋白分别转染hPDLSCs：取第四代hPDLSCs 接种于24 孔板。将Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9 分别加入贴壁生长的细胞中，设为Ad-GFP组、Ad-BMP2 组、Ad-BMP7 组、Ad-BMP9 组。荧光转染率约为50%，8 h 后换液并培养5～7 d，PBS冲洗。

ALP 染色：采用4%多聚甲醛固定30 min，PBS染色，将250 μL BCIP／NBT 染色工作液加入到孔板中，室温孵育30 min，ddH2O 洗涤、吸弃染液2 次并终止反应，倒置显微镜观察各组ALP 染色情况。ALP 活性检测：每孔分别加入200 μL 0.2% Triton X-100裂解细胞，于1.5 mL EP 管中置入刮取裂解物，1 200 r／min 离心3 min，取上清液，严格按照说明书操作，根据标准曲线与作用时间计算样本ALP活性值，检测ALP 活性。每组设6 复孔，3 复孔用以ALP 染色，3 复孔用以检测ALP 活性。

将活性最高的BMPx 作为研究对象，按以上方法转染第五代hPDLSCs，并做不同处理。设置5 组：空白组、Ad-GFP 组、Ad-BMPx 组、Ad-BMPx ＋2.5 μmol／L BIX02189 组及Ad-BMPx ＋10 μmol／L BIX02189 组，每组设3 复孔。细胞贴壁后，Ad-GFP组加入适量Ad-GFP，Ad-BMPx 组、Ad-BMPx ＋2.5 μmol／L BIX02189 组及Ad-BMPx ＋10 μmol／L BIX02189 组加入适量Ad-BMP9，空白组加适量PBS，8 h 后换液，Ad-BMPx＋2.5 μmol／L BIX02189组及Ad-BMPx＋10 μmol／L BIX02189 组分别加入2.5 μmol／L 和10 μmol／L BIX02189。7 d 后行ALP染色，镜下观察各组ALP 染色情况。

1.6 茜素红染色

分为Ad-GFP 组、Ad-BMP2 组、Ad-BMP7 组、Ad-BMP9 组与空白组、Ad-GFP 组、Ad-BMPx 组、Ad-BMPx ＋2.5 μmol／L BIX02189 组、Ad-BMPx ＋10 μmol／L BIX02189 组。当荧光感染率达到30%后8 h 换液（50 mg／L 维生素C＋10 mmol／L β-磷酸甘油），21 d 后PBS 冲洗，采用4%多聚甲醛固定30 min，PBS 冲洗，将0.2%茜素红染色液200 μL 加入到每个孔板中，室温孵育60 min，ddH2O 洗涤3 次并使显色反应终止，倒置显微镜观察各组成骨晚期分化指标钙盐沉积情况。

1.7 qRT-PCR

分为Ad-GFP 组、Ad-BMP2 组、Ad-BMP7 组、Ad-BMP9 组。培养7 d 后使用PBS 冲洗，使用微量核酸蛋白检测仪检测分离的细胞总RNA 纯度和浓度。遵循试剂盒的操作说明书，使用Bio-rad CFX实时荧光定量PCR 仪检测成骨分化相关基因OCN、OPN 的mRNA 表达，成骨分化相关基因的相对表达量通过内参β-actin 与Bio-rad CFX Manager 软件进行参照分析（表1）。

分为空白组、Ad -GFP 组、Ad -BMPx 组、Ad-BMPx＋2.5 μmol／L BIX02189 组、Ad-BMPx ＋10 μmol／L BIX02189 组。采用qRT-PCR 检测成骨分化相关基因OCN、OPN、OSX、RUNX2 的mRNA 表达。（表1）

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.8 Western blot 检测

分为空白组、Ad -GFP 组、Ad -BMPx 组、Ad-BMPx＋2.5 μmol／L BIX02189 组、Ad-BMPx ＋10 μmol／L BIX02189 组。培养24 h 后提取总蛋白并进行蛋白浓度测定。电泳分离、封闭、转膜，加入p-ERK5 一抗（1 ∶1 000）及β-actin 一抗（1 ∶5 000），4 ℃孵育12 h，加入HRP 标记的二抗（1 ∶5 000），应用ECL 化学发光法显色。

1.9 统计学分析

通过EPidata 3.1 软件双人录入收集的研究资料，SPSS 25.0 统计软件进行数据分析，计数资料以¯x±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 鉴定和培养hPDLSCs

光学显微镜下可见牙周膜组织应用组织块酶分解后呈长梭状的纤维细胞，漩涡状增殖为传代后表现。细胞荧光染色法显示波形蛋白呈阳性，角蛋白表达呈阴性，说明培养的hPDLSCs 来源于中胚层间充质细胞，而非来源于上皮细胞。镜下显示生长2 周的hPDLSCs 形成克隆，密度较大，呈圆形（图1）。

图1 鉴定和培养hPDLSCsFig.1 Identification and culture of hPDLSCs

2.2 BMPs 促进hPDLSCs 细胞成骨分化

ALP 染色和活性检测显示，与Ad-GFP 组比，Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9 三组的ALP 表达显著增加（P＜0.05），Ad-BMP9 组早期成骨ALP 的表达最高，其次为Ad-BMP2 和Ad-BMP7（图2A、2B）。

qRT-PCR 结果显示，与Ad-GFP 组比，Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9 三组的细胞成骨分化相关基因OCN 和OPN mRNA 均显著增加（P＜0.05），Ad-BMP9 组的OCN 和OPN mRNA 最高，其次为Ad-BMP2 和Ad-BMP7（图2C）。

茜素红染色结果显示，与Ad-GFP 组比，Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9 三组的钙盐结节沉积显著增加，Ad-BMP9 组晚期成骨诱导最强，其次为Ad-BMP2 和Ad-BMP7（图2D）。

以上结果表明，相对于Ad-BMP2、Ad-BMP7，Ad-BMP9 具有较强的促hPDLSCs 成骨分化作用。因此，将Ad-BMP9 用于后续实验，研究BMPs-ERK5 信号通路与hPDLSCs 细胞成骨分化的关系。

2.3 ERK5 信号通路参与BMP9 诱导hPDLSCs 成骨分化

Western-blot 检测显示（图3），与空白组及Ad-GFP 组比，Ad-BMP9 组的ERK5 磷酸化（p-ERK5）表达显著增加（P＜0.05）；与Ad-BMP9 组比，Ad-BMP9 ＋2.5 μmol／L BIX02189 组和Ad-BMP9＋10 μmol／L BIX02189 组的p-ERK5 表达显著 降 低（P＜0.05）；与Ad -BMP9 ＋2.5 μmol／L BIX02189 组比，Ad-BMP9＋10 μmol／L BIX02189 组的p-ERK5 表达显著降低（P＜0.05）。

ALP 染色和活性检测显示（图4A、4B），与空白组及Ad-GFP 组比，Ad-BMP9 组的ALP 表达显著增加（P＜0.05），与Ad-BMP9 组比，Ad-BMP9 ＋2.5 μmol／L BIX02189 组 和Ad-BMP9 ＋10 μmol／L BIX02189 组的ALP 表达显著降低（P＜0.05），与Ad-BMP9 ＋2.5 μmol／L BIX02189 组 比，Ad-BMP9 ＋10 μmol／L BIX02189 组的表达显著降低（P＜0.05）。

qRT-PCR 检测显示（图4C），与空白组及Ad-GFP 组比，Ad-BMP9 组的成骨分化相关基因OCN、OPN、OSX、RUNX2 mRNA 表达显著增加（P＜0.05），与Ad -BMP9 组 比，Ad -BMP9 ＋2.5 μmol／L BIX02189 组和Ad-BMP9＋10 μmol／L BIX02189 组的OCN、OPN、OSX、RUNX2 mRNA 表达显著降低（P＜0.05），与Ad-BMP9＋2.5 μmol／L BIX02189 组比，Ad-BMP9 ＋10 μmol／L BIX02189 组的OCN、OPN、OSX、RUNX2 mRNA 表达显著降低（P＜0.05）。茜素红染色结果显示（图4D），与空白组及Ad-GFP组比，Ad-BMP9 组的钙盐结节沉积显著增加，与Ad -BMP9 组 比，Ad -BMP9 ＋2.5 μmol／LBIX02189 组和Ad-BMP9＋10 μmol／L BIX02189 组的钙盐结节显著降低，与Ad-BMP9 ＋2.5 μmol／L BIX02189 组比，Ad-BMP9＋10 μmol／L BIX02189 组的钙盐结节显著降低。

图2 BMPs 促进hPDLSCs 细胞成骨分化Fig.2 BMPs promoted osteogenic differentiation of HPDLSCs cells

图3 Western-blot 检测各组细胞p-ERK5 蛋白表达Fig.3 The expression of p-ERK5 protein in each group detected by Western-blot

以上结果表明，ERK5 信号通路未被抑制时，Ad-BMP9具有较强的促hPDLSCs 成骨分化作用，当ERK5 信号通路被特异性抑制时，Ad-BMP9 的促hPDLSCs 成骨分化作用也被抑制，提示ERK5 信号通路可调节BMP9 诱导的hPDLSCs 细胞的成骨分化作用。

图4 ERK5 信号通路参与BMP9 诱导的hPDLSCs 成骨分化Fig.4 ERK5 signaling pathway involved in regulating BMP9-induced osteogenic differentiation of hPDLSCs

3 讨论

包括牙槽骨、牙骨质和牙周膜的牙周支持组织完全再生是治疗牙周病的理想结果［8］。作为治疗牙周疾病的新方法，组织工程技术具有巨大潜力，而其中发挥主要作用的就是种子细胞［9］。一般来说，当维持牙周生理性动态平衡的牙槽骨出现失衡时，就会伴随着病理性过程的发生，间充质干细胞则是参与维持上述动态平衡的细胞［10］。相关研究表明，干细胞的各项功能受到严密的分子调控［11］。从干细胞到成骨细胞分化过程中，多种细胞因子、生长因子信号可参与其中，如目前已被证实的GFF、Wnt、BMP 和PI3K／Akt 等，这些信号通路通过影响成骨细胞相关的关键转录因子参与其中［12］。BMPs 信号通路通过Smad 途径调控靶基因的转录表达，MAPKs 信号途径则是刺激信号从细胞表面到核内的重要传递者［13］。ERK5，属于丝氨酸蛋白激酶，磷酸化激活后由胞浆释放到胞核，增强其转录活性，通过与转录因子MEF 结合，进而调控细胞抗凋亡、分化和血管生成等的生物学行为［14］。

相关研究表明，MERK1／ERK1 和MERK2／ERK2分别对骨生长起到正向和负向调节的作用，但目前BMPs-ERK5 信号通路对hPDLSCs 成骨分化的影响尚不清楚［15］。本研究通过组织块酶消化法分离获得hPDLSCs，通过腺病毒载体介导及转染的方式，使hPDLSCs 高表达BMP9、BMP2 及BMP7 蛋白，对比3种BMPs 对hPDLSCs 成骨分化的作用效果。进一步，将对hPDLSCs 成骨分化影响最强的BMPs 再次转染hPDLSCs，检测其p-ERK5 水平，并加入BMPs-ERK5信号通路特异性抑制剂BIXO2189 预处理后，考察对hPDLSCs 成骨分化的影响。早期成骨分化、成骨分化相关基因及晚期成骨分化指标均显示，Ad-BMP2、Ad-BMP7 及Ad-BMP9具有较强的hPDLSCs 成骨分化作用，Ad-BMP9促进hPDLSCs 成骨分化的作用最强。进一步，在ERK5 信号通路特异性抑制剂BIX02189干扰下，ERK5 表达降低，Ad-BMP9 的hPDLSCs 成骨分化作用也被抑制，且呈BIX02189 剂量依赖性的趋势，提示ERK5 信号通路可调节BMP9 诱导的hPDLSCs 细胞的成骨分化作用，类似文献也显示，BMP9 的成骨分化诱导过程由ERK5 信号通路参与介导［16-17］。

综上所述，在慢性炎症微环境下，BMP9 具有可诱导hPDLSCs 成骨分化的作用，ERK5 信号通路可调节BMP9 诱导的hPDLSCs 的成骨分化作用。