三物黄芩汤对白塞氏病小鼠炎症因子及STAT3蛋白的影响

朴勇洙，张京，王欣波，任慧，齐堉潼，朱彬

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

白塞氏病(Behcet's disease,BD)是以葡萄膜炎和结节性红斑、生殖器溃疡、复发性口腔溃疡为主要临床特征, 并可累及胃肠道、心血管、神经、血液等多系统损伤的慢性多系统血管炎。本病属于免疫功能紊乱性疾病，患者往往对外界病原体的免疫反应减弱，但是对于自身器官组织的免疫反应却表现为亢进。现代临床医学治疗手段主要以服用非甾体抗炎药、免疫制剂、糖皮质激素, 但是因其停药易再次发作，西医无法彻底根除, 而中医运用中医药为治疗手段取得较好的临床疗效。非甾体抗炎药作为临床上治疗白塞氏病的药物之一, 因患者长期服用而导致机体对该药耐药性的产生，是治疗失败的主要原因[1]。因此, 探索白塞氏病耐药性的分子调控机制, 寻找有效的干预靶点可为提高白塞氏病治疗效果产生积极影响。由于长期运用三物黄芩汤治疗白塞氏病患者效果显著，为求进一步探索其作用机制，设计课题研究三物黄芩汤对白塞氏病小鼠外周血炎症因子及相关蛋白的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

选取雌性清洁级4～6周龄的BALB/c小鼠，体质量(25±2)g，在室温(22±2)℃，相对湿度55%～60%，安静环境下适应性饲养1周。自由摄食，给予充足清洁饮水。

1.2 药材及制备

三物黄芩汤草药黄芩6 g，苦参6 g，生地黄12 g，由黑龙江中医药大学实验中心提供。

1.3 主要仪器

水平摇床(WD-9405B)；电泳仪(DYY-7C)；转移槽(DYCZ-40D)；双垂直蛋白电泳仪(DYCZ-24DN)；凝胶成像系统(WD-9413B型，北京六一)。微量移液器(Proline，苏州BIOHIT公司)；超纯水系统(NW10LVF，香港Heal Force公司)；超速冷冻离心机(H-2050R ，长沙湖南湘仪公司)；酶标仪(ELX-800，美国BIOTEK公司)；电热恒温培养箱(DH36001B，天津泰斯特公司)；倒置相差显微镜(型号IX53，日本OLYMPUS公司)；CO2培养箱(型号HF-90,中国上海力申公司)；超净工作台(型号SW-CJ-2FD,中国苏州苏净安泰公司)。

1.4 主要试剂

全蛋白提取试剂盒(WLA019)；全蛋白提取试剂盒(WLA019)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(WLA004)；SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒(WLA013)；Western洗涤液(WLA025)；SDS - PAGE电泳液(干粉)(WLA026)；SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(WLA005)；ECL发光液(WLA003)；p-STAT3(WLP2412)；STAT3(WL03207)；羊抗兔IgG-HRP(WLA023)；内参抗体 β-actin(WL01845，中国wanleibio公司)，预染蛋白分子量标准(26616,加拿大Fermentas公司)；PVDF膜(IPVH00010,美国Millipore公司)；BSABS043(中国Biosharp公司)；脱脂奶粉(Q/NYLB 0039S,中国伊利公司)。小鼠外周淋巴细胞分离液试剂盒(产品编号P8620，中国索莱宝公司)；IFN-γELISA检测试剂盒(产品编号SEA049Mu，中国武汉优尔生科技股份有限公司)；沙利度胺(产品编号T126856)、ionomycin(产品编号I139530，中国阿拉丁公司)；PBS(产品编号P10033，中国双螺旋公司)；CD4-FITC(产品编号11-0042-81)、IFN-γ-PE(产品编号12-7311-81)，(美国eBioscience公司)；PMA(产品编号HY-18739，美国MCE公司)；BrefeldinA(产品编号HY-16592，中国Aladdin公司)。

2 实验方法

2.1 过敏原制作

取中国对虾虾肉，去除其头、尾、虾线。虾肉被置于缓冲液A(50 mmol/L KCl、2 mmol/L NaHCO3)溶液中，充分匀浆，4 ℃离心取沉淀，重复操作4次。预冷的丙酮洗涤沉淀，搅拌，将虾肉中残留的丙酮充分挥发。制备好的虾肌肉丙酮粉被置于缓冲液B(20 mmol/L Tris-HCl、1 mol/L KCl、0.1 mmol/L DTT)中抽提过夜，4 ℃离心取上清。调节上清液的pH至4.5，并缓慢加入40%(NH4)2SO4溶液，充分搅拌，4 ℃离心取沉淀；取上清液再次加入40%(NH4)2SO4溶液，充分搅拌，4 ℃离心取沉淀。用缓冲液B分别溶解上述2次沉淀，沸水浴加热10 min，冰上迅速冷却，4 ℃离心，取其上清，得到提取中国对虾原肌球蛋白液。将提取的中国对虾原肌球蛋白液进行SDS-PAGE蛋白纯度鉴定，将蛋白分装保存用于后续实验。

2.2 模型制作

BALB/c小鼠60只，分为空白组、模型组、沙利度胺组、三物黄芩汤各剂量组，每组10只。各组小鼠生活环境为12 h白12 h黑，温度(22±1)℃，湿度45%～55%，自由进食饮水。适应性喂养1周后再建立模型，除空白组外，剩余各组小鼠于第7、14、21、28天腹腔注射(0.1 mL的弗氏佐剂和0.1 mL 12 mg/mL对虾原肌球蛋白)浓度为6 mg/mL的过敏原，建立小鼠白塞氏病模型。

2.3 实验动物给药

空白组小鼠给予同等体积的生理盐水。沙利度胺组小鼠于第28天后腹腔注射75 mg/kg沙利度胺，1次/日，持续到第56天。三物黄芩汤低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组小鼠，1次/日灌胃三物黄芩汤(低剂量：1 g/kg、中剂量2 g/kg、高剂量4 g/kg)。模型组、沙利度胺组、三物黄芩汤低剂量治疗组、三物黄芩汤中剂量治疗组、三物黄芩汤高剂量治疗组小鼠在第56天腹腔注射0.4 mL浓度为6 mg/mL的过敏原致敏激发。末次腹腔注射激发2 h后，摘眼取血一部分加肝素抗凝，一部分分离血清后储存于-70 ℃超低温冰箱，收集脾脏组织液氮冻存后转入-70 ℃超低温冰箱中保存，用于后续实验。

2.4 外周血单核细胞的分离

向管内加入外周血，摇匀，再加入等体积室温PBS稀释血液。向15 mL离心管内放入等体积淋巴细胞分离液，倾斜试管，将稀释后的血液沿试管壁缓慢加至分层液上面。将离心管置于水平式离心机内，18～20 ℃，2 000 rpm离心20 min。离心后，将吸管轻轻的插入灰白色层，小心的吸出PBMC。 转入干净离心管内，PBS清洗细胞2次。弃上清，以后续试验所需相应液体质量悬细胞。

2.5 Western印迹法检测STAT3及P-STAT3蛋白的表达

Western blot检测脾脏组织中STAT3及P-STAT3蛋白表达水平收集STAT3及P-STAT3，用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度后，用Western blot检测STAT3及P-STAT3蛋白表达水平，取40 μg蛋白，经10%SDS-PAGE电泳分离，电转印至PVDF膜，封闭后加入一抗(β-actin antibody 1∶1 000，STAT3 1∶500，P-STAT3 1∶500)，4 ℃摇床孵育过夜，加HRP标记二抗(β-actin antibody 1∶5 000，STAT3 1∶5 000，P-STAT3 1∶5 000)，孵育 1h，最后利用增强化学发光液(enhanced chemiluminescence，ECL)显色，在暗室曝光，凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的光密度值，以观察各组STAT3及P-STAT3蛋白表达水平。

2.6 相关炎症因子标本采集及检测

将IFN-γ4 000 pg/mL的标准品稀释成1 000 pg/mL。稀释后标准品浓度依次为：1 000 pg/mL，500 pg/mL，250 pg/mL，125 pg/mL，62.5 pg/mL，31.2 pg/mL，15.6 pg/mL。洗涤，加样酶标板加上覆膜，37 ℃温育1 h，显色，终止反应，测定进行试验，该操作严格按照IFN-γ试剂盒说明书进行。

2.7 统计学分析

3 结果

3.1 各组小鼠血清中炎症因子的水平

与空白组小鼠比较,模型组的炎症因子水平明显升高(P<0.01)，表明白塞氏病小鼠的炎症因子水平显著升高。给予沙利度胺、三物黄芩汤后，与模型组相比小鼠的炎症因子水平明显降低 (P<0.01或P<0.05)，但沙利度胺组与中药高剂量组之间小鼠的炎症因子水平无显著差异(P>0.05)见表1。

表1 各组小鼠炎症因子水平比较

3.2 各组小鼠P-STAT3蛋白含量的水平

与空白组相比，模型组小鼠的P-STAT3蛋白含量明显升高(P<0.01)；而给予沙利度胺、三物黄芩汤后，与模型组相比小鼠的P-STAT3蛋白明显降低(P<0.01或P<0.05)。但沙利度胺组和中药高剂量组P-STAT3蛋白含量比较无显著性差异(P>0.05)。见图1、表2。

注：A：空白组;B：模型组;C：沙利度胺组;D：三物黄芩汤低剂量治疗组;E：三物黄芩汤中剂量治疗组;F：三物黄芩汤高剂量治疗组。图1 各组小鼠外周血P-STAT3蛋白比较

表2 各组小鼠外周血P-STAT3蛋白比较

3.3 实验进行至第56天时测量并记录各组小鼠体质量

与空白组相比，模型组小鼠体质量明显降低(P<0.01)；与模型组相比，沙利度胺组及三物黄芩汤高剂量组体质量有明显差异(P<0.01，<0.05)；三物黄芩汤中、低剂量组与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表3。

表3 各组小鼠体质量比较

4 讨论

白塞氏病中医病名称为“狐惑病”，其中医发病机理多与湿热相关，查阅古籍《金匮悬解》：“狐惑者，狐疑惶惑，绵昧不明，状如伤寒。……此盖湿气遏郁，精神昏愦之病也。湿邪淫泆，上下熏蒸，浸渍糜烂，肌肉剥蚀。”三物黄芩汤具有清热凉血滋阴, 解毒燥湿坚阴之效，黄芩、生地黄、苦参均为味苦、性寒之品，黄芩、苦参能够清热燥湿除脾胃之湿热之邪，生地黄滋阴清热使热祛而不伤阴津，三物黄芩汤首见于《金匮要略·妇人产后病脉证并治第十二》曰:“妇人在草蓐……头痛者, 与小柴胡汤, 头不痛但烦者, 此汤主之。”方中黄芩中黄芩苷 (baicalin) 分子式为C21H18O11，是从传统中药黄芩中提取的一种经过尿嘧啶核甙二磷酸盐葡萄糖醛酸化的黄酮类葡萄糖醛酸苷， 是黄芩的主要有效成分之一[2]。黄芩苷能够抑制白介素1β细胞因子，并且抑制炎症相关蛋白酶的转录水平从而缓解炎症反应，延长细胞生命力[3]。氧化苦参碱是苦参中的主要起效成分，可以双向调节淋巴细胞的增殖，又能够抑制TNF-α、IL-6和IL-8等炎症因子凸显其抗炎免疫的作用[ 4]。方中生地黄为君药, 行凉血通利、滋阴益肾的功效, 通过药理研究发现功效似糖皮质激素免疫抑制作用[5]。综上所述三物黄芩汤中的三味中药均有抗炎、调节免疫的作用，同时在临床治疗白塞氏病患者疗效显著为本研究奠定了研究基础。

白塞病是一种多系统慢性炎症性疾病，具有复杂的遗传背景，导致先天和适应性免疫系统的促炎性激活[6-7]。CD4+和CD8+T细胞都产生Th1型促炎细胞因子白细胞介素2、白细胞介素12和干扰素(IFN-γ)在BD的外周血(PB)和炎症组织中增加[8-9]。Th17细胞是一个相对较新的辅助性T细胞亚群，主要产生白细胞介素-17A、白细胞介素-17F、白细胞介素-22和肿瘤坏死因子(肿瘤坏死因子-α)[10]。最近的数据也暗示白细胞介素-17和Th17型应答在BD中参与发病机理[11-12]。活跃BD的特点是白细胞介素-6、白细胞介素-17、白细胞介素-23和活化的Th17细胞血清水平高[13-15]。STAT3在Th17分化和白介素-17产生中起关键作用[16]。STAT3激活的特征在于STAT3磷酸化，此前的研究表明活跃性白塞氏病患者表现出STAT3磷酸化水平升高[17-18]。JAK/STAT信号通路对于先天和适应性免疫系统的激活至关重要。干扰素γ受体、白细胞介素2R和白细胞介素6R通过JAK1信号，与JAK2或JAK3配对，而白细胞介素12和白细胞介素23通过JAK2/Tyk2途径激活[19]。STAT3对调节Th17的平衡至关重要以及促进CD4+T细胞增殖。STAT3结合多个基因，尤其是白介素-6，参与Th17细胞的分化、激活、增殖和存活，调节表达和表观遗传修饰。STAT3在IFN-γ信号通路中也有重要作用，其高度参与大多数自身免疫过程。因此，STAT3在炎症和体内平衡中协调了T细胞功能的多个关键方面[20]。有研究已经证明JAK1/STAT3信号通路在BD中被激活，可能通过升高血清和组织中Th1/Th17型细胞因子的表达[21]。所以抑制STAT的磷酸化在治疗白塞病至关重要，实验研究通过观察炎症因子IFN-γ干扰素、白介素17A的含量及P-STAT3蛋白表达水平来讨论三物黄芩汤在白塞氏病中的作用机制。

本研究发现运用中药高剂量组和西药沙利度胺组治疗一个月后与模型组相比小鼠的炎症因子水平和P-STAT3蛋白明显降低，说明三物黄芩汤和沙利度胺均可降低白塞氏病小鼠的炎症因子和P-STAT3蛋白含量，实验证明了三物黄芩汤可以降低炎症因子水平、抑制STAT3的磷酸化，其抑制STAT3的磷酸化可能与JAK1/STAT3信号通路有关，本文为中药治疗白塞氏病提供新思路。