黄芩苷对心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制

刘萍，唐代，王旭，白云

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

心肌缺血再灌注损伤(I/R)致死率非常高，全球每年有超过600万人死于I/R[1]。目前治疗策略主要是通过经皮冠状动脉介入治疗(PCI)动脉放支架、采用溶栓或直接血管成形术恢复动脉血流。但是，除了直接的缺血性损伤，血流的复灌还会对心肌组织造成损伤，这种现象称为再灌注损伤，其机制与心肌细胞的死亡有关[2]。再灌注损伤的发病机制涉及多种机制的相互作用，包括血管收缩剂的释放、非再灌注、深度炎症反应、细胞凋亡和坏死[3]。

在心脏再灌注过程中，会释放多种细胞因子，导致心脏局部炎症，进而导致组织损伤。许多研究表明，抑制过度炎症可以减少梗死范围，改善缺血再灌注损伤引起的心功能障碍[4]。与缺血再灌注损伤相关的是氧化/还原失衡导致活化氧和活化氮介导的信号通路的激活。氧化应激被认为是早期心肌缺血再灌注损伤的病理变化[5-6]。

心肌梗死导致心脏组织缺血性坏死，这是死亡的主要原因。梗死后，促炎性免疫细胞，尤其是多形核白细胞/单核细胞，被迅速募集到心脏。浸润性中性粒细胞和巨噬细胞被激活，从而引发炎症、氧化应激和细胞外基质成分沉积[7]。

众所周知，激活NF-κB和MAPK可导致心肌缺血。NF -κB和MAPK通路已被证明参与许多生理功能，包括高血压、心力衰竭和心肌肥大等。许多研究表明抑制MAPK信号与激活核因子-红细胞2相关因子2 (Nrf-2)能显著缓解心脏损伤，Nrf-2同时可以调控血红素加氧酶1(HO-1)。许多研究表明HO-1心肌缺血再灌注中起到至关重要的作用[8-9]。

心血管疾病是全世界的主要死亡原因，不仅影响高收入国家，也影响低收入和中等收入国家。冠心病和缺血性心肌病是最重要的心血管疾病类型。随着心血管疾病的治疗，现代医学有了显著的进步。抗心绞痛药物等是心血管疾病的一线治疗药物。与此同时，一些中药因其显著的临床疗效而逐渐进入公众视野。黄芩是亚洲地区常用的中草药之一，临床应用历史悠久，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。黄芩苷，又称7-葡萄糖醛酸-5，6-二羟基黄酮，是从黄芩(唇形科)中分离得到的一种黄酮类化合物，在中药中被广泛用作治疗各种炎症性疾病。以往的研究表明，黄芩苷具有广泛而有效的生物活性，包括抗炎、抗病毒和抗肿瘤作用。然而，关于黄芩苷治疗I/R的报道虽有一些，但是报道比较浅显。因此本文重点研究黄芩苷对心肌缺血再灌注的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂

黄芩苷(纯度：97%)由上海源叶生物有限公司提供。白细胞介素-1β(IL-β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫试剂盒购自Elabscience。心肌酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)购自南京建成生物工程有限公司。所有抗体购自于美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 动物

雄性SD大鼠(8周龄，200～220 g)由黑龙江中医药大学动物中心提供，并且饲养在黑龙江中医药大学动物中心SPF级动物房，湿度：55%～70%，温度：23～25 ℃。所有SD大鼠自由饮水饮食。所有动物操作严格按照黑龙江中医药大学动物伦理指南操作。

1.3 实验动物分组、给药及处理

SD大鼠分组如下(n=10):假手术(Sham)组、缺血再灌注(I/R)组、I/R+地尔硫卓组(Dil)、I/R+BA(20、40、80 mg/kg) 组。假手术组大鼠不进行接扎，灌注正常进行。假手术组和I/R组大鼠给予生理盐水2周。Dil和BA治疗组大鼠分别给予Dil(20 mg/kg,灌胃)和BA(20、40、80 mg/kg，灌胃)4周，随后进行缺血再灌注。按照之前报道[10]手术过程如下:大鼠按照体质量，腹腔注射氨基甲酸乙酯(0.5 mL/100 mg)麻醉大鼠。随后，大鼠以仰卧位固定在手术台上，将大鼠小心链接到四导心电图上，手术过程中检测手术过程中的变化，并同时监测心电图以排除异常的大鼠。小心地分离大鼠的气管，并小心切开后立即用与呼吸机进行机械通气(呼吸频率60次/min，潮气量8 mL，频率5∶4)。气管内插管后，小心分离大鼠颈总动脉并插入导管，同时将压力传感器连接到生物信息收集系统。仔细去除SD大鼠的胸毛，然后用碘伏仔细消毒皮肤。打开左胸暴露心脏，剥去心包找到冠状动脉，穿过离左心耳2 mm的小乙烯管，使结扎线(4/min线)形成一个环来结扎冠状动脉。左前降支结扎30 min，随后，再灌注120 min。假手术组流程一样，只是不接扎。心肌缺血再灌注手术完成后，实验者小心地将大鼠的肌肉和皮肤逐层缝合，并在切口处注射少量青霉素或擦拭碘伏以消毒伤口，防止伤口感染。

1.4 缺氧-复氧(H/R)实验方案

取对数生长期生长的H9C2细胞，弃去原来的培养液，加入含有95% N2和5% CO2混合气体液培养，连续培养6 h，模拟缺氧。随后加入含有有95% O2和5% CO2混合气体的培养液复氧。

1.5 细胞活力测定

H9C2心肌细胞接种在96孔板1×105/孔。在H/R方案进行之前，细胞给予不同浓度的BA (1、2、4、8和16 μL)下孵育12 h，然后根据上述细胞活力进行评估。根据CCK-8检测试剂盒说明，加入10 μL的CCK8溶液并在450 nm波长处读取吸光度。

1.6 心电图测量

SD大鼠按体质量给予氨基甲酸乙酯(0.5 mL/100 mg)，然后将大鼠固定在实验板上的背部位置，用皮肤覆盖颈部和胸部，然后用碘伏消毒，铺无菌孔巾，将针状心电图电极插入大鼠四肢皮肤下，连接心电图仪，监测并记录心电图变化。

1.7 血清与细胞上清细胞因子检测

根据ELISA制造商的说明书方法测定血清、和细胞上清液中IL-6、IL-β和TNF-α的含量。

1.8 心肌酶检测

根据试剂盒说明书，并且严格按照说明书流程，检测血清CK和LDH水平。

1.9 血清和细胞上清液中SOD、MDA测定

根据试剂盒说明书，并且严格按照说明书流程，检测血清和细胞上清液中SOD、MDA。

1.10 心肌组织学检查

将4%多聚甲醛固定的心脏组织包埋于石蜡，制备4 μm切片，按常规HE染色程序操作。在光学显微镜下观察心脏病理学改变。

1.11 蛋白质印迹

用RIPA裂解液提取心脏组织和H9C2细胞的总蛋白，并收集12 000 rpm离心20 min。BCA试剂盒用于定量蛋白含量。各组蛋白样品用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。然后将PVDF膜置于5%脱脂奶粉封闭2 h。随后将PVDF膜置于相应的一抗(p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-P38、P38、HO-1、Nrf-2、p-P65、P65、Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2)中，在4 ℃孵育过夜。第二天用TBST洗4次，每次8 min。然后将聚偏氟乙烯膜置于二抗，并在室温下于摇床中培养2 h。取下聚偏氟乙烯膜，用TBST水洗4次，每次8 min。凝胶成像系统用于曝光和扫描条带，以分析每个条带的灰度值。

1.12 统计分析

2 结果

2.1 BA对心肌组织病理学的影响

如图1所示，假手术组大鼠心脏结构完整，正常的肌原纤维结构伴有条纹，分支外观和与相邻肌原纤维的连续性。心脏结扎手术后的心脏出现大量浸润性炎症细胞、心肌细胞肿胀、变性、心脏坏死和横纹消失。BA (20、40、80 mg/kg)与Dil(20 mg/kg)显著改善了上述病理变化。

图1 BA对心肌组织病理学的影响(×200)

2.2 BA对H9C2细胞活力的影响

如图2所示，将细胞暴露于缺氧6 h，然后再给氧24 h后24 h通过CCK8分析检测细胞活力。缺氧6 h导致细胞活力显著下降，而BA增加了H9C2细胞的活力。

注：与正常组比较,##P<0.01;与H/R比较,**P<0.01。图2 BA对H9C2细胞活力的影响

2.3 BA对心电图ST段的影响

如图3所示，与假手术组相比，缺血再灌注组的ST段明显升高，结果表明，BA(20、40、80 mg/kg)与Dil(20 mg/kg)显著降低ST段。

图3 BA对心电图ST段的影响

2.4 BA对血清、细胞上清液中炎性细胞因子的影响

如表1与表2所示，缺血再灌注组血清与缺氧/复氧组细胞上清液中IL-6、IL-β和TNF-α水平明显升高。BA或Dil显著降低血清、细胞上清液中IL-6、IL-β和TNF-α的水平。

表1 BA对血清中炎性细胞因子的影响

表2 BA对细胞上清炎性细胞因子的影响

2.5 BA对心脏标志酶的影响

如表3所示，与假手术组大鼠相比，I/R组大鼠的CK和LDH水平明显升高。与I/R组相比，MAF和Dil显著降低CK和LDH水平。

表3 BA对心脏标志酶的影响

2.6 BA对血清SOD、MDA的影响

如表4所示，与假手术组比较，I/R组大鼠血清SOD显著降低、MDA显著升高，BA与Dil显著降低MDA、升高SOD。

表4 BA对血清SOD、MDA的影响

2.7 BA对缺血再灌注大鼠心脏MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB通路的影响

如图4所示，与假手术组大鼠比较，I/R组大鼠心脏组织中p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65的水平显著升高，Nrf-2和HO-1的水平显著降低。BA与Dil能显著恢复上述改变。

图4 BA对缺血再灌注大鼠心脏MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB通路的影响

2.8 BA对H/R诱导H9C2细胞MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB通路的影响

如图5所示，与正常组细胞比较，H/R组H9C2细胞中p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65的水平显著升高，Nrf-2和HO-1的水平显著降低。BA能显著恢复上述改变。

图5 BA对H/R诱导H9C2细胞MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB通路的影响

3 讨论

目前，对心血管疾病的干预有很多，如对冠心病的溶栓和冠状动脉搭桥术。尽管死亡率显著下降，但与这些治疗相关的缺血再灌注损伤使结果不太令人满意。因此，在研究中，需要预防和治疗缺血再灌注心脏疾病。在本实验中，BA显著改善了I/R组大鼠ST抬高，减少了CK-MB和LDH水平，改善了心肌病理变化，并恢复了炎症和氧化应激相关的通路。

目前治疗心肌缺血的药物有几种:一是钙通道阻滞剂，如硝苯地平、地尔硫卓等;第二，抗氧化剂自由基发生剂，如维生素C等;第三类是能量混合物磷酸肌酸;第四，抗白细胞聚集，如乌司他丁。其中，第一类钙离子阻滞剂是治疗心肌缺血最常用的药物，也是治疗心肌缺血应用最广泛的药物。其他研究者也报道了地尔硫卓对心肌缺血再灌注损伤的治疗作用[11-13]，这是我们在本实验中选择地尔硫卓作为阳性药物的基础。

据报道，MAPK通路是细胞存活和凋亡所必需的信号通路[15-17]。在这方面，我们假设BA对心肌缺血再灌注的保护作用与MAPK信号通路有关。正如预期的那样，本研究结果显示BA显著降低了I/R大鼠和H/R的H9C2细胞中ERK 1/2、JNK和p38磷酸化的水平。作为MAPK的下游分子，NF-κB在心肌缺血炎症和凋亡进程的调节中起着重要作用[18-19]。NF-κB的激活是由IκBα的磷酸化和降解诱导的[20]。NF-κB调节炎症细胞因子的产生、氧化应激和凋亡反应[21]。有证据表明MAPK/NF-κB通路参与体内和体外心肌缺血再灌注损伤[22]。本实验结果证实，与假手术组比较，在I/R模型中p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65的水平显著增加。与I/R相比，BA与Dil显著降低p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65水平。H9C2细胞在H/R刺激后，p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65水显著升高，BA显著降低p-JNK、p-ERK、p-P38和p-P65水平。

I/R可引起细胞因子如IL-6、IL-β和TNF-α。TNF-α主要由巨噬细胞分泌，巨噬细胞可通过增加其他促炎细胞因子的释放和影响中性粒细胞募集来促进炎症级联反应。IL-6作为炎症中的一种重要细胞因子，在缺血再灌注引起的炎症中起着重要作用。IL-β可以诱导其他炎症介质的释放，增加细胞粘附因子的表达，促进中性粒细胞与内皮细胞的粘附。实验结果表明，BA和Dil显著降低了大鼠血清IL-6、IL-β和TNF-α的水平。H/R刺激H9C2细胞后，血清IL-6、IL-β和TNF-α的水平显著升高，BA能降低细胞上清IL-6、IL-β和TNF-α的水平。

研究表明，抑制MAPK激活可以激活Nrf-2，然后上调HO-1[23]。活化的Nfr-2从Keap 1(Nrf-2的抑制剂)中释放出来，并转移到细胞核，在细胞核中与抗氧化反应元件(ARES)结合，加速HO-1的表达。据报道，HO-1是第二阶段抗氧化酶之一，在I/R中起关键作用[24]。本结果证实，与假手术组相比，I/R组大鼠的Nrf-2、HO-1和SOD水平显著降低，MDA水平显著升高。与I/R组相比，BA和Dil能提高Nrf-2、HO-1和SOD水平，降低MDA的水平。H/R刺激后H9C2细胞后细胞Nrf-2、HO-1和SOD水平显著降低、MDA显著升高，BA能显著逆转上述改变。

综上所述，BA对I/R有显著的保护作用，其机制与调控MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB信号介导的氧化应激与炎症相关。