林蛙油冻干粉抗疲劳、抗衰老药理作用研究

李孟，吕邵娃，管庆霞，刘艳，杨大宇，杨炳友*，张凤春，刘志茹，李永吉

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江四宝生物科技股份有限公司，黑龙江 铁力 152500)

林蛙油为雌性林蛙输卵管的干制品，其主要成分包括蛋白质、固醇和磷脂，有着极高的药用价值[1-2]。现代药理研究发现林蛙油具有抗氧化、抗衰老、增强免疫力、减轻疲劳等多种生物学作用[3-6]。为使林蛙油易于保管和贮藏，便于服用，将其经冷冻干燥制成粉末，但林蛙油冻干粉上述功效是否能与新鲜林蛙油保持一致仍有待研究。本文以林蛙油冻干粉为研究对象，综合比较林蛙油冻干粉与林蛙油的抗疲劳、抗衰老药理作用，为今后开发林蛙油产品及进一步市场开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD品系大鼠，体质量(180±20)g。青岛市实验动物和动物实验中心提供，合格证号SCXK(鲁)20140001。

1.2 药物与试剂

林蛙油冻干粉(黑龙江四宝生物科技股份有限公司提供，批号：20171101)；贞芪扶正颗粒(修正药业集团有限公司，批号：170020)；血清睾酮试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：H090)；血清皮质酮试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：H205)；尿素氮试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：C013-2)；糖原试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：A043)；CAT试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：A007-1-1)；MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：A003-1)；NO试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：A013-2)；SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：A001-3)；GR试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：A062)。

1.3 实验仪器

101A-1E型电热鼓风干燥箱(上海实验仪器有限公司)；FA2004分析电子天平(上海良平仪器仪表)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；VICTOR X3酶标仪(PerkinElmer公司)；TDL-4型低速台式离心机(上海安享科学仪器厂)；108 mL手动组织匀浆器(天津玻璃仪器厂)；H2050R型台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.4 分组与处理方法

取雄性SD大鼠，实验室内温度保持在(22±2)℃，相对湿度55%～75%，光照时间随自然变化。大鼠均以基础饲料和蒸馏水常规饲养，自由饮食，实验大鼠适应性饲养1周后，以20 min的运动量对其进行筛选，淘汰不适应游泳训练的大鼠，将剩余56只大鼠按照随机分组法分为7组：①静止对照组：大鼠生理盐水灌胃1 mL/d，每日1次；②运动对照组：大鼠生理盐水灌胃1 mL/d，每日1次；③林蛙油冻干粉低剂量干预组：以0.05 g/kg浓度林蛙油冻干粉混悬液腹腔注射，每日1次；④林蛙油冻干粉中剂量干预组：以0.10 g/kg浓度林蛙油冻干粉混悬液腹腔注射，每日1次；⑤林蛙油冻干粉高剂量干预组：以0.20 g/kg浓度林蛙油冻干粉混悬液腹腔注射，每日1次；⑥林蛙油组：以0.10 g/kg浓度林蛙油混悬液腹腔注射，每日1次；⑦贞芪扶正颗粒组：贞芪扶正颗粒以0.30 g/kg浓度配置后腹腔注射，每日1次。各组连续干预30 d，于末次给药60 min后进行负重5%游泳力竭实验(静止对照组除外)，测定大鼠体质量变化和力竭时间，随后麻醉，取腹主动脉血测定相关指标。大鼠处死前12 h禁水禁食。

1.5 5%游泳力竭实验

采用100 cm×50 cm×60 cm的玻璃泳槽作为大鼠游泳训练装置，水深50 cm。水温(31±2)℃。为防止大鼠在水面漂浮不动，特在游泳箱底部放置佳宝“AP1500”型水泵形成流动水，使大鼠游泳至力竭。大鼠开始游泳至力竭所用时间为力竭运动时间，力竭标准以大鼠下沉后10 s不露出水面为度，记录力竭时的游泳时间。

1.6 检测指标

在大鼠游泳力竭测试后24 h称体质量，水合氯醛适度麻醉，从腹主动脉处取血，4 ℃，3 000 r/min离心，分离制备血清。用试剂盒检测大鼠血清睾酮、皮质酮、BUN、肝糖原、肌糖原、NO、MDA、SOD、GR、CAT等指标。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 体质量及力竭时间测试

运动对照组的体质量与静止对照组比较无统计学意义。林蛙油冻干粉各给药组分别与运动对照组相比，体质量升高、力竭时间延长，具有极显著性(P<0.01)。在相同剂量下林蛙油冻干粉与林蛙油组相比，无显著性差异,见表1。

表1 林蛙油冻干粉对大鼠体质量及力竭时间的影响

2.2 对大鼠血清睾酮、皮质酮的影响

运动对照组与静止对照组相比，血清睾酮含量下降、睾酮/皮质酮数值降低，且具有极显著性(P<0.01)。林蛙油冻干粉中、高剂量给药组与运动对照组相比，均能增加血清睾酮含量、睾酮/皮质酮比值(P<0.05或P<0.01)。相同剂量下的林蛙油冻干粉与林蛙原油组相比，林蛙油组抗疲劳作用更加明显(P<0.05)。见表2。

表2 林蛙油冻干粉对大鼠血清睾酮、皮质酮的影响

2.3 对大鼠尿素氮(BUN)和肝、肌糖原储量的影响

运动对照组与静止对照组比较，BUN含量升高，肝糖原含量降低，肌糖原含量降低，且具有极显著性(P<0.01)。林蛙油冻干粉中剂量组与运动对照组相比，前者使BUN含量降低且具有显著性(P<0.05)。且在相同剂量下林蛙油冻干粉与林蛙油组相比，干预组的抗疲劳的作用更加明显(P<0.01)。见表3。

表3 林蛙油冻干粉对大鼠BUN和肝、肌糖原含量的影响

2.4 对大鼠血清中NO、MDA、SOD、GR、CAT活力的影响

运动对照组与静止对照组相比， NO含量、MDA含量升高，SOD含量、GR含量、CAT含量降低，且具有极显著性差异(P<0.01)。林蛙油各给药组与运动对照组相比，NO含量降低且具有极显著性差异(P<0.01)；MDA含量降低，SOD含量、GR含量、CAT含量明显升高，具有极显著性差异(P<0.01)。见表4。

表4 林蛙油冻干粉对大鼠血清中NO、MDA、SOD、GR、CAT活力的影响

3 讨论

近年来通过对林蛙油研究发现其可以增加机体肝糖原储量，提高运动耐力，改善物质能量代谢，帮助降低血液中乳酸含量，即能减慢疲劳的产生速度同时又能帮助快速消除疲劳，又有一定的抗疲劳功效[7]。同时研究也表明[8]，林蛙油能明显降低血液中丙二醛含量，提高谷胱甘肽过氧化酶活性，同时清除自由基，表现出良好的抗氧化、抗衰老的药理作用。研究采用贞芪扶正颗粒对照，贞芪扶正颗粒由黄芪、女贞子组成。黄芪能够补气固表，能够调节虚劳诸证；女贞子能够补肝益肾，《草本备要》中言其 “益肝肾，安五脏，强腰膝，明耳目，乌须发，补风虚，除百病”，两药合用能够扶正益气。动物实验结果显示黄芪多糖能够提高小鼠免疫功能；女贞子多糖可以提高小鼠的非特异性细胞的免疫功能，同时具有延缓机体衰老的作用。现代药理学证实[9]，贞芪扶正颗粒能够提高机体的免疫功能并保护肾上腺皮质和骨髓功能，帮助机体调节身体平衡状态，治疗多种疾病引起的机体虚损状态。

睾酮作为人体内重要的促合成激素，可以刺激组织摄取氨基酸，促进核酸与蛋白质的合成，促进肌纤维和骨骼的生长，增强免疫力抵抗疲劳，从而增强运动能力[10]。而皮质醇作为促分解激素可减少蛋白质合成、降低运动能力。睾酮与皮质醇比值可衡量合成代谢的稳定情况，进而反映运动能力以及疲劳程度[11]。

BUN指血浆中除蛋白质以外的一种含氮化合物，它从肾小球滤过而排出体外。在肾功能不全失代偿时，BUN将升高，所以临床以将其作为判断肾小球滤过功能的指标[12]。BUN过高会引发肾功能障碍，也是评价机体承受运动负荷能力的重要指标之一。肌糖原是骨骼肌中重要的能量来源，其贮备量与运动的耐力呈正相关。肝糖原则主要用于维持血糖的相对稳定。肝糖原耗竭，血糖水平下降，会使运动肌和中枢神经供能不足，导致外周和中枢疲劳。所以增加肝、肌糖原储备，减少糖损耗，是延缓疲劳发生的重要措施[13]。

NO携带一个未配对电子，在体内极不稳定，这一特性恰好和其它游离自由基一样，这样两者就非常容易结合产生反应，从而使体内自由基数量大大减少。衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联，NO含量的降低可以起到抗氧化的作用。丙二醛是氧自由基氧化细胞膜上磷脂形成的脂质过氧化物的稳定存在形式，可反应机体内脂质过氧化程度，它的产生还能加剧膜的损伤。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，不断地补充SOD，具有抗衰老的特殊效果。GR催化机体内氧化型谷胱甘肽还原成谷胱甘肽，谷胱甘肽能和氧自由基结合，清除机体内部的氧合自由基，以减少自由基对机体的损害。CAT存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不至于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH，对机体具有保护作用[14]。

本研究目的探究林蛙油冷冻干燥后制成的粉末林蛙冻干粉治疗效果，通过不同剂量林蛙油冻干粉与贞芪扶正颗粒进行对比研究，同时以血清睾酮、皮质醇、BUN等为综合指标，考察了林蛙油冻干粉对大鼠抗疲劳、抗衰老药理作用的影响。结果显示林蛙油冻干粉0.20 g/kg组的大鼠相比其他组体质量升高、力竭时间延长程度更优，提示该浓度下的大鼠抗疲劳程度更强。此外，通过对比各组血清睾酮、皮质酮的影响作用，发现高剂量的冻干粉组增加更为明显，提示该组大鼠运动能力以及疲劳程度更强。对比各组大鼠尿素氮(BUN)和肝、肌糖原储量数值，结果显示高剂量的冻干粉组能更好的促进肝、肌糖原的储备，延缓疲劳的发生。最后对比大鼠血清中NO、MDA、SOD、GR、CAT值，结果显示林蛙油冻干粉组能更好的清除氧化自由基，起到抗氧化抗衰老的作用。

综上所述,不同浓度林蛙油冻干粉均具有一定抗疲劳、抗衰老作用。且高浓度优于低浓度，本研究结果揭示了林蛙油新产品的优势，为林蛙油新产品的开发提供了实验依据。