基于网络药理学探讨丹参-葛根药对治疗糖尿病心肌损伤的分子机制

刘思莹，凌爽，李雪莹，刘欣欣，肖洪彬*

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007；3.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

糖尿病心肌损伤是糖尿病常见的心血管并发症，是机体在糖脂代谢紊乱的基础上长期发展而诱发的心肌结构和功能的损伤而引发的微血管病变，也是糖尿病患者心血管疾病的高发生率和高病死率的重要原因。

丹参-葛根药对是《施今墨对药》中益胃止渴健脾降糖中的一对，葛根甘平，轻扬升发，能解肌退热，生津止渴，滋润筋脉，扩张心脑血管，改善血液循环，降低血糖；丹参色赤入血，活血化瘀，行血止痛，祛瘀生新，凉血消痈，镇静安神，降低血糖。二药参合，相互促进，活血化瘀，祛瘀生新，降低血糖力量增强[1]。研究发现，丹参、葛根都具有调节心血管的功能，在改善糖尿病微血管病变[2]、心肌缺血[3]、心肌损伤[4]方面都具有显著效果，但对于二药在糖尿病血管病和心肌损伤保护作用的药效学和作用机制研究相对较少。

中药网络药理学是在生物信息学的基础上，整合多个中药数据库和数据分析软件对中药化学成分、作用靶点以及疾病的等信息进行分析，并构建“成分-靶点-基因-疾病”的分子网络，阐述其生物学功能和作用机制，其研究方法与中药及中药复方的多组分、多靶点、多通路等特点相吻合，也正符合中医辨证论治、整体观、系统观的医疗理念相符[5-6]。本文采用网络药理学研究方法利用“成分-靶点-疾病”的思路对“丹参-葛根”药对治疗糖尿病心肌损伤构建网络拓扑模型，经过数据分析对“丹参-葛根”药对的生物学功能和作用机制提供更准确的信息，希望对今后的科学研究和临床应用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 丹参-葛根化学成分和靶点筛选

利用TCMSP (中药系统药理学数据库与分析平台，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，收集丹参、葛根主要化学成分及其对应的靶点。采用网络药理学常用的化学成分筛选方法，以生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18作为 ADME筛选条件[7]。

1.2 疾病靶点的筛选

通过在GeneCards数据库 (http://www.genecards.org) 和OMIM 数 据 库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) 进行检索，输入关键词diabetic heart injury，DMI和diabetes cardiomyopathy，DCM获得糖尿病心肌损伤相关的疾病靶点。

1.3 药对和疾病交集靶点的网络构建

将疾病靶点与药物成分靶点输入在线Venny 2.1软件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制韦恩图，获得药对与疾病的交集靶点。将筛选得到的交集靶标蛋白输入STRING 10.5平台(https://string-db.org/)构建蛋白-蛋白相互作用网络，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，隐藏网络中孤立的蛋白，其他参数保持默认设置，导出网络互作图，分析统计靶标蛋白关联频次。

1.4 药对-疾病-靶点的网络构建

利用Cytoscape 3.7.2(http:/ /www.cytoscape.org/)[8]软件。将“丹参-葛根”药对化合物和疾病交集靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建药对-靶点-疾病网络，使药物分子与交集靶点关系达到可视化，进行网络拓扑学分析，以靶点度值(Degree)和中心度(betweenness centrality)作为拓扑结构分析的重要参数，预测药对中有效成分和靶标蛋白在网络中的重要程度。

1.5 丹参-葛根药对治疗糖尿病心肌损伤预测靶标富集分析

利用DAVID(https:/ /david.ncifcrf.gov)在线分析工具将靶点基因symbol转化为基因ID，并进行基因本体(GO)富集分析，再利用Kabas3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn)在线软件进行生物通路KEGG富集分析，并使用R语言cluster Profiler工具包对富集分析结果进行可视化操作，选择P<0.01显示结果。

2 结果

2.1 丹参-葛根药对有效成分和靶点的筛选

通过TCMSP数据库，以OB≥30%和DL≥0.18为参数共收集到了69个满足条件的化合物，剔除预测不到靶点的化合物共得到41个有效成分，其中丹参38个，葛根3个，见表1。同时得到的有效靶点共434个，剔除重复靶点共得到65个有效作用靶点，通过数据统计分析发现：丹参中化合物紫丹参萜醚B(przewalskin b)，分子编号MOL007064，在41个化合物中具有较高的OB值(110.32%)。

2.2 与糖尿病心肌损伤相关疾病靶点筛选

通过 Genecard、OMIM数据库进行检索，获得糖尿病心肌损伤相关的疾病靶点580个。将580个疾病靶点与65个药对成分靶点通过Venny 2.1软件取交集后得到疾病-药物成分共同靶点29个，见图1。

图1 疾病-药对交集靶点关系图

2.3 药对-疾病交集靶点PPI网络构建

将交集靶标蛋白在STRING 10.5平台(https://string-db.org/)构建蛋白-蛋白互作网络，设置置信度大于0.4，隐藏孤立蛋白后，共得到28个节点，107条线，平均节点度值(degree)为7.38，见图2。节点表示靶标蛋白，每条边表示靶标蛋白之间的作用关系。从作用关系图可看出有13个靶点大于平均度值，成为连结网络其他节点的枢纽，主要有IL-6、VEGFA、CASP3、FOS、CASP8、CASP9、ESR1、MCL1、NFKBIA、PPARG、GSK3B、ICAM1、PRKCA，说明这些蛋白质在PPI中发挥着关键的作用。

图2 丹参-葛根治疗糖尿病心肌损伤的靶点蛋白质交互作用图

2.4 药对化合物-靶点-疾病网络构建

应用cytoscape3.7.2软件构建“丹参-葛根”药对-疾病-核心靶点之间的关系网络，见图3，共包括70个节点，包括41个化合物节点和29个核心靶点节点，组成454条靶点联系；其中，蓝色椭圆表示化合物，红色椭圆表示“药对-疾病”作用靶点，节点连线与度值成正比例关系。度中心性(degree centrality，DC)参数是评价网络节点重要核心指标，其数值越大，说明节点越接近网络的中心[9]。核心靶点中度值较高的有 PTGS1(28)、CHRM3(25)、CHRM2(20)等，表明丹参-葛根药对化合物可能通过高度值的靶点起到发挥治疗糖尿病心肌损伤的作用。

图3 丹参-葛根活性成分-DMI交集靶点网络图

2.5 预测靶标的GO和KEGG富集分析

应用DAVID在线软件对丹参-葛根药对治疗DMI的交集靶点基因进行GO功能富集分析，得到前20条目富集结果，见图4。靶点关联的分子功能主要有蛋白质异二聚活性、类固醇激素受体活性、内肽酶活性、半胱氨酸型内肽酶活性、类固醇结合、配体调节序列特异性DNA结合-转录因子活性、半胱氨酸型肽酶活性、RNA聚合酶II转录因子结合、神经递质受体活性、核受体活性、细胞因子受体结合等。

图4 丹参-葛根治疗 DMI作用靶点Go富集分析结果

利用Kabas3.0将交集靶点做富集通路分析，取前20条主要通路及富集的基因，将得到的通路富集分析结果使用R语言clusterProfiler工具包绘制气泡图，选择P<0.01显示结果，见图5。在显示的生物通路中主要涉及凋亡信号通路、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、内分泌IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、催乳素信号通路、p53信号通路、内分泌抵抗、Toll样受体信号通路、胰岛素抵抗、HIF-1信号通路、甲状腺激素信号通路等。

图5 丹参-葛根治疗DMI作用靶点KEGG富集气泡图

3 讨论

丹参、葛根在糖尿病及其并发症的治疗中均属高频使用单味药。相关研究表明，治疗糖尿病心血管并发症最常用的中药中，丹参、葛根排在了前10位[10]。而该药对的组合应用在现代药理学实验证实，二者具有降低血糖、调节糖代谢的作用[11-12]。

本研究应用网络药理学方法，探讨和分析了丹参-葛根药对治疗糖尿病心肌损伤的分子机制。筛选了丹参-葛根药对共41个特征化学成分，主要作用65个靶点，其中29个靶点为药对与疾病交集靶点。PPI网络图显示了核心靶点的相互作用关系，网络中靶点连接度越大，表明该药对通过该靶点治疗DMI的可能性越大。其中IL-6(度值19)、VGEFA(度值18)、Caspase3(度值17)、FOS(度值14)、ESR1(度值12)、Caspase8(度值12)、Caspase9(度值12)等靶蛋白在网络中连接基因数远高于其他，说明这些关键靶点又是相互作用协同起到治疗糖尿病心肌损伤的作用。 Caspase3、Caspase7、Caspase8、Caspase9属于Caspases家族成员中促凋亡因子，是一组具有相似氨基酸序列、空间结构和酶特异性的半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡信号的刺激下caspase参与了糖尿病胰岛β细胞的凋亡[13]。IL-6参与炎症反应，降低IL-6的水平可以减轻糖尿病患者血管病变，其机制可能与抑制炎症反应有关[14]。王明乐等[15]采用丹参注射液对2型糖尿病下肢血管病变患者进行干预，血清炎症因子IL-6、C反应蛋白(CRP)的炎症指标明显降低,表明丹参注射液对炎症因子的干预效果显著。靶点基因通路富集分析主要集中在凋亡信号通路(9个靶点参与)、PI3K-Akt信号通路(8个靶点参与)、TNF信号通路(7个靶点参与)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(6个靶点参与)、IL-17信号通路(6个靶点参与)等信号通路。BULANI等[16]研究表明，糖尿病心肌病与心肌细胞凋亡有密切相关，高糖环境会增加心肌细胞的凋亡。张玲等[17]研究葛根素能够改善DM模型大鼠的血糖并调控Bcl-2表达，下调Caspase3、Cyt-C蛋白表达，从而使心肌细胞凋亡率下降。孙晓慧等人[18]研究表明Sirt1 通过负调控 PI3K/Akt/mTOR信号通路参与糖尿病心肌损伤，参与早期糖尿病心肌病的发生发展。袁媛等[19]证实了葛根素对体内外AGEs的形成具有明显的抑制作用。白介素17(IL-17)在心脏间质纤维化的发病机理中起着重要作用。Zhang Y等[20]通过敲除IL-17消除了高糖诱导的AK081284的上调，从而抑制了心脏成纤维细胞(CFs)中胶原和TGFβ1的产生。证明了 IL-17 / AK081284 /TGFβ1信号通路介导高葡萄糖诱导的胶原蛋白产生。IL-17的缺失能够减轻心肌纤维化并改善糖尿病小鼠的心脏功能。该研究表明IL-17抑制对与纤维化有关的糖尿病性心肌病的治疗潜力。

综上所述，网络药理学的平台分析和预测结果和已有实验验证结果基本一致，说明通过网络药理学的方法能够在分子层面为药物对疾病的作用机制提供一些潜在依据和线索，本研究应用网络药理学方法揭示了丹参-葛根药对治疗DMI 的多成分、多靶点和多通路的协同作用的特点，为进一步深入研究该药对组合配伍或药物单体化合物特有的药理作用以及治疗糖尿病心肌损伤的作用机制提供了重要的理论依据。