异补骨脂素改善骨质疏松大鼠骨代谢的作用探讨

尚延春 张海英 柴巍巍

河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院),河南 郑州 450000

骨质疏松症是常见的内分泌疾病，可增加全身骨折的风险。据统计[1]，我国50岁以上居民的骨质疏松症发病率已高达19.2 %，且呈上升趋势。目前治疗骨质疏松症的常用药物有双膦酸盐、降钙素、雌激素等[2]，虽有一定作用但副作用大，仍需优化。异补骨脂素是补骨脂的重要成分，被证实具有抗骨质疏松作用[3]。有实验证实[4]，核心结合因子α1(core binding factor α 1，Runx 2)/人基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP13)信号通路可参与骨质疏松大鼠骨组织破坏病变。但是异补骨脂素是否能通过上述信号通路途径治疗骨质疏松症尚未可知。鉴于此，本研究将设计进行大鼠对照试验以探讨上述问题。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：50只SD大鼠，均为雌性，7周龄，180～220 g，平均(205.42±10.12)g，SPF级，均购自河南省实验动物中心，合格证号：SCXK(豫)20180001。

1.1.2实验药物：异补骨脂素干粉，购自上海纯优生物科技有限公司，纯度≥98 %。

1.1.3试剂与仪器：维酸钾购自博士德生物工程有限公司；血钙甲基百里酚蓝(methyl thymol blue，MTB)法检测试剂盒、血磷钼酸法测定试剂盒、血清骨钙素(bone gla protein，BGP)、尿胶原砒啶交联N末端肽(N-terminal telopeptides of typeⅠcollagen，NTX)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒均购自美国OXTEX公司；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色试剂盒、脱氧核苷酸(deoxynucleotide，DNA)提取试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒均购自美国Bio-Rad公司；兔抗鼠Runx 2、MMP13单克隆抗体、山羊抗兔Runx 2、MMP13多克隆抗体均购自美国Invitrogen 公司；Runx 2、MMP13及内参(β-actin)均由深圳晶美生物科技公司设计合成。DPX型双能X射线骨密度仪购自Lunar公司；UH4150型紫外/可见分光光度计购自天美(中国)科学仪器有限公司；7600型全自动生化分析仪购自日本ATACH公司；BX53型光学显微镜购自日本Olympus公司；9700型聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪购自美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1建模、分组与干预：将50只SD大鼠采用随机数字表分为为5组：正常对照组、模型空白组、异补骨脂素低浓度组、异补骨脂素中浓度组、异补骨脂素高浓度组，每组10只。除正常对照组外，均采用维甲酸灌胃建立骨质疏松症大鼠模型：取维酸钾和1 %羧甲基纤维素钠，混合均匀并配置成终浓度为含7 %维酸钾的混悬液，1 mL/100 g灌胃，每天1次，持续2周[5]。与此同时，正常对照组大鼠每天灌胃1 %羧甲基纤维素钠+蒸馏水，共2 mL，每天1次。建模成功后，异补骨脂素低浓度组、异补骨脂素中浓度组、异补骨脂素高浓度组分别给予25、50、100 mg/kg异补骨脂素(溶于2 mL生理盐水中)灌胃，正常对照组和模型空白组给予2 mL生理盐水灌胃，每天1次，每周停用1 d，持续3个月。

1.2.2骨密度检测：分别于治疗前后采用双能X射线骨密度仪检测大鼠股骨近端、L4～6腰椎骨骨密度，取平均值。

1.2.3骨代谢检测：分别于治疗后取大鼠尾静脉血3 mL检测骨代谢指标，其中血钙、血磷分别采用MTB法、钼酸法测得；BGP和NTX均采用ELISA法检测。

1.2.4骨结构变化检测：治疗后将实验大鼠断头处死，取股骨干骺端组织1 mm3。常规脱钙、切片、脱蜡、水化，给予苏木精染色。以盐酸酒精分化，以氨水返蓝，持续5 s后以自来水冲洗1 min。伊红染色，梯度浓度乙醇脱水，固定封片后镜检。

1.2.5骨组织Runx 2、MMP 13 mRNA检测：取股骨干骺端组织常规提取总核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，测定其浓度与纯度。Runx 2上游引物：5’-ACTGATCGTTGCTAGCTAGGCT-3’，下游引物：5’-CTGACTGCTAGCTAGTTTGATC-3’；MMP13上游引物：5’-CTCGATCGATAAACTAGCTGGA-3’，下游引物：5’-CCGGATCGATGGTTCAGTAGTT-3’；β-actin上游引物：5’-TTAAACTAGCTAGTTTAGCTAA-3’，下游引物：5’-CTCTCGATCAGTCTAGTCATGG-3’。PCR反应：94 ℃(5 min)→94 ℃(40 s)→51 ℃(40 s)→72 ℃(1 min)，35个循环，72 ℃(10 min)。分析目的基因的相对表达强度。

1.2.6骨组织Runx 2、MMP 13蛋白表达检测：取股骨干骺端组织BCA蛋白定量，上样。电泳分离并转膜，洗膜后以脱脂牛奶封闭10 min。加入一抗，4 ℃过夜；洗脱后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，漂洗。染膜，暗室内曝光，分析目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料组间比较采用单因素方差分析(F检验)，每两组间比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异补骨脂素对骨质疏松症大鼠骨密度的影响

建模和干预期间正常对照组、模型空白组、异补骨脂素低浓度组、异补骨脂素中浓度组、异补骨脂素高浓度组分别有1、3、2、2、1只死亡，多死于灌胃时不慎穿破食道，有2只大鼠死亡原因未明。治疗前后采用双能X线骨密度仪测量骨密度，正常对照组骨密度均无明显变化(P<0.05)，余四组骨密度均下降(P<0.05)。治疗后与正常对照组比较，其余四组骨密度均下降(P<0.05)；与模型空白组比较，异补骨脂素三个浓度组的骨密度均升高(P<0.05)，且呈浓度依赖。见表1。

表1 异补骨脂素对骨质疏松症大鼠骨密度的影响Table 1 Effect on bone mineral density in rats with osteoporosis

2.2 异补骨脂素对骨质疏松症大鼠骨代谢的影响

分别采用MTB法、钼酸法、ELISA测定治疗后各组大鼠的骨代谢。与正常对照组比较，模型空白组血钙无明显变化(P>0.05)，异补骨脂素三个浓度组的血钙均升高(P<0.05)，且呈浓度依赖；各组血磷均相近(P>0.05)；与正常对照组比较，其余四组BGP均下降(P<0.05)，NTX均升高(P<0.05)；与模型空白组比较，异补骨脂素三个浓度组的BGP均升高(P<0.05)，NTX均下降(P<0.05)，且呈浓度依赖。见表2。

表2 异补骨脂素对骨质疏松症大鼠骨代谢的影响Table 2 The effects on bone metabolism in rats with osteoporosis

2.3 异补骨脂素对骨质疏松症大鼠骨结构的影响

通过HE染色观察骨质疏松症大鼠的骨结构，正常对照组可见骨小梁形态结构完整，髓腔相对小，且腔内造血细胞丰富；模型空白组骨小梁数目显著减少，形态结构破坏严重，骨髓腔内造血细胞数量显著减少，脂肪细胞显著增多；异补骨脂素低浓度组骨小梁数目明显减少，形态结构破坏明显，骨髓腔内造血细胞数量明显减少，脂肪细胞明显增多；异补骨脂素中浓度组骨小梁数目减少，形态结构遭破坏，骨髓腔内造血细胞数量减少，脂肪细胞增多；异补骨脂素高浓度组骨小梁数目轻微减少，形态结构轻微受损，骨髓腔内造血细胞数量轻微减少，可见少量脂肪细胞。见图1。

图1 骨质疏松大鼠骨结构HE染色(×50)注：A：正常对照组；B：模型空白组；C：异补骨脂素低浓度组；D：异补骨脂素中浓度组；E：异补骨脂素高浓度组。Fig.1 HE staining of bone structure in osteoporotic rats (×50)

2.4 异补骨脂素对骨质疏松大鼠骨组织Runx 2、MMP 13 mRNA表达的影响

采用qRT-PCR方法检测骨质疏松症大鼠骨组织Runx 2、MMP 13 mRNA表达。与正常对照组比较，其余四组Runx 2 mRNA表达水平均下降(P<0.05)，与模型空白组比较，异补骨脂素三个浓度组的Runx 2 mRNA表达水平均升高(P<0.05)，且呈浓度依赖；MMP13 mRNA变化趋势正相反。见表3。

表3 异补骨脂素对骨质疏松大鼠骨组织Runx 2、MMP 13 mRNA表达的影响Table 3 Effects on the expressions of Runx 2 and MMP 13 mRNA in bone tissues of osteoporotic rats

2.5 异补骨脂素对骨质疏松大鼠骨组织Runx 2、MMP13 蛋白表达的影响

采用Western blotting方法检测骨质疏松大鼠骨组织Runx 2、MMP 13 蛋白表达。与正常对照组比较，其余四组Runx 2 蛋白表达水平均下降(P<0.05)；与模型空白组比较，异补骨脂素三个浓度组的Runx 2 蛋白表达水平均升高(P<0.05)，且呈浓度依赖；MMP 13 蛋白表达趋势正相反。见表4和图2。

图2 异补骨脂素对骨质疏松大鼠骨组织Runx2、MMP13 蛋白表达的影响注：A：正常对照组；B：模型空白组；C：异补骨脂素低浓度组；D：异补骨脂素中浓度组；E：异补骨脂素高浓度组。Fig.2 Effects on the expressions of Runx2 and MMP13 proteins in bone tissues of osteoporotic rats

表4 异补骨脂素对骨质疏松大鼠骨组织Runx 2、MMP13 蛋白表达的影响Table 4 Effects on the expressions of Runx 2 and MMP13 proteins in bone tissues of osteoporotic rats

3 讨论

补骨脂中含有丰富的异补骨脂素，在既往的大鼠实验研究[6]中证实补骨脂注射液可促进成骨细胞的增殖，抑制成骨细胞的凋亡。该药物还可促进体外培养的骨髓间充质干细胞的增殖与分化，并且还可促进BGP的分泌，减少钙盐沉积，证实异补骨脂素是抗骨质疏松的有效成分[7]。本次研究采用维甲酸与1 %羧甲基纤维素钠混合灌胃建立骨质疏松症大鼠模型，相较于常规去卵巢造模方法可减轻对大鼠造成的伤害，符合实验动物福利原则，与刘颖等[8]报道的造模方法一致。但有研究[9]认为，该方法建模成功率不理想，可能是由于维酸钾与1 %羧甲基纤维素钠混合灌胃对骨吸收和骨形成的影响不显著，作用缓慢。本研究发现治疗后异补骨脂素三个浓度组的骨密度和骨代谢均显著改善，作用效果呈浓度依赖性。

Runx 2是转录因子Runxx家族的重要成员之一，是一种特异性转录因子，可参与骨组织的形成和重建。Runx 2决定着多能干细胞向成骨细胞的分化，并且还可促进软骨的血管化，加快软骨细胞的成熟，与破骨细胞与细胞外基质的形成也密切相关[10-11]。MMP13是靶向软骨降解的主要酶，主要局限于结缔组织，具有特异性切割II型胶原作用，在骨骼发育和软骨重建中均有参与[12]。有报道发现[13-14]，通过调控骨组织Runx 2/MMP13信号通路的基因与蛋白表达可促进骨细胞的增殖，诱导其向成骨细胞分化，改善骨代谢和骨微结构，是骨质疏松症临床治疗研究的新靶点。本研究推测异补骨脂素可对骨组织Runx 2/MMP13信号通路产生调控作用，对骨代谢的调控作用、骨结构的保护作用很可能均通过此途径实现。

本研究中异补骨脂素三个浓度组的骨结构破坏减轻，可见异补骨脂素可减轻骨质疏松症大鼠的骨结构破坏，且呈浓度依赖性。此外，异补骨脂素三个浓度组的骨组织Runx 2 mRNA及蛋白表达均高于模型空白组，MMP13 mRNA与蛋白表达均低于模型空白组，推测异补骨脂素可调控骨质疏松大鼠骨组织Runx 2/MMP13信号通路，促进Runx 2基因及蛋白表达，抑制MMP13基因及蛋白表达，从而实现骨保护作用。Jian Wang等[15]研究发现异补骨脂素对骨质疏松症大鼠模型疗效理想，且发现该药物可减轻其氧化应激反应；Ge L等[16]指出异补骨脂素可通过激活成骨细胞的生物学活性改善骨代谢，也证实该药物在骨质疏松症治疗方面有良好的应用前景。

综上所述，在骨质疏松症大鼠中采用异补骨脂素治疗可提高大鼠的骨密度，改善骨代谢，并且可上调Runx 2 mRNA及蛋白表达、下调MMP13 mRNA及蛋白表达。