维生素E治疗对老年雌性大鼠骨量、骨代谢以及自噬水平影响

杨海超 黄炜 韩晓东

唐山市工人医院，河北 唐山 063000

老年骨质疏松症的发病率随着世界人口的老龄化而逐渐增加。由于高昂的医疗费用、高风险残疾率、与死亡风险增加密切相关[1]，老年骨质疏松性骨折已成为一个重要的公共卫生问题。然而，有关老年性骨量流失的病理生理分子机制尚不完全清楚。随着年龄的增长，骨细胞数量明显减少，骨细胞自噬和凋亡增加[2]。自噬是一种进化保守的生理过程，是生存、分化、发育和细胞内稳态所必需的[3]。自噬的基础水平作为一种重要的细胞垃圾处理机制，通过去除功能异常的细胞器和错误折叠的蛋白质来维持细胞内环境的稳态[4]。此外，随着年龄的增长，骨细胞的自噬功能减弱可能与老年骨质疏松的发生发展有关[4]。最近有研究[5]表明，自噬是骨细胞抵抗糖皮质激素有害影响的主要保护机制。近年来的研究[6]表明抗氧化剂可以通过改变体内的自噬水平减少骨质疏松大鼠骨量的流失。随着年龄的增长，骨细胞自噬的失败可能是老年性骨质疏松发生的原因之一，因此改变自噬水平可能成为治疗老年性骨质疏松的治疗靶点。本研究的目的是探讨抗氧化剂维生素E对老年雌性大鼠骨密度、骨代谢和自噬水平影响。

1 材料和方法

1.1 材料

选取3月龄雌性Sprague-Dawley大鼠10只、体重230～250 g作为对照组；另选取24月龄雌性Sprague-Dawley大鼠20只，体重487～532 g，均购于上海实验动物中心。大鼠饲养在室温(23±2)℃环境下，12/12 h光暗循环，喂食标准大鼠饲料和水。将老年大鼠随机分为模型组(n=10)和治疗组(n=10)。所有大鼠适应性饲养1周。

1.2 方法

1.2.1维生素E治疗：将3 g维生素E (Sigma，USA) 溶解在50 mL橄榄油(Bertolli，Lucca，意大利)中，以获得60 mg/kg剂量的溶液[7]，治疗组给予大鼠每天60 mg/kg维生素E灌胃治疗。本研究中使用的维生素E含有162.2 mg/g α-生育酚，167.1 mg/g α-生育三烯醇，35.4 mg/g β-生育三烯醇，266.2 mg/g γ-生育三烯醇和90.7 mg/g δ-生育三烯醇，剂量表现出对骨量保护作用[7]；大鼠每天60 mg/kg的剂量相当于体重60 kg的人每天摄入583 mg维生素E。其它组的大鼠给予同样剂量的橄榄油治疗。治疗12周后，在禁食12 h后对大鼠实施安乐死，获取血液和双侧股骨标本。本研究得到医院伦理委员会批准(201922344)。

1.2.2Micro-CT和HE染色评估:通过Micro-CT(SkyScan 1176，Bruker-microCT，Kontich，Belgium)检测大鼠股骨的骨小梁微观结构。对于所有测试，扫描条件保持相同(分辨率：18 mm;源电压:65 kV;源电流:385 μA;旋转步骤:0.7)。每组选取8只大鼠用于Micro-CT测量。在这些区域中，骨小梁由股骨干骺端内侧的皮质骨内部限定，且骨小梁区域定义为距离股骨干骺端的生长板约(0.5±2.0)mm。Micro-CT系统中的软件用于分析骨小梁微观结构的参数，如骨密度(BMD)、骨体积/总体积(BV / TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。随后对股骨进行组织学检测，骨组织在10 % EDTA溶液中脱钙4～6周，此溶液每周更换一次。待脱钙满意后将骨组织浸入乙醇中脱水(70 %过夜，然后浓度分别为80 %、85 %、90 %和95 %，持续2 h，终浓度为100 %)。然后将样品用二甲苯酚处理并包埋于石蜡中。用苏木精和伊红对4 μm厚股骨干骺端切片进行染色。使用配备有Leica DFC310FX数码相机的Leica DM4000B光学显微镜进行观察和分析。

1.2.3血清学检测：在处死大鼠前通过心脏穿刺采集血样。血样在3 000 r/min，4 ℃下离心15 min，获得血清标本。血清骨钙素(OC)水平使用市售的ELISA试剂盒(Takara，Co，Ltd.)检测。采用TRAPTM酶联免疫检测试剂盒(ELISA,IDS，Tyne&Ware，UK)检测骨吸收标志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRACP-5b)的水平。所有检测程序均按照检测试剂盒的制造商协议执行。

1.2.4蛋白质印迹分析：将新鲜股骨在液氮中冷冻并在RIPA缓冲液[10 mmol/L Tris(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，0.5%NP-40,0.1%SDS，0.1%脱氧胆酸盐，1 mmol/L PMSF和2 mmol/L氟化钠]中均质化，原料琥珀酸钠，补充有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，St.Louis，MO，USA)和PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)。将含有等量蛋白质的组织裂解物在10 %SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离并转移到PVDF膜上，将其在PBST中和一抗在4 ℃下封闭孵育过夜。在PBST中洗涤，将膜与二抗一起孵育，最后用增强的化学发光(ECL)系统显现信号。GAPDH用作内部对照。

1.3 统计学分析

结果以均数±标准差表示，使用Windows版本 SPSS 22.0对进行分析。采用student’t检验分析两组之间的差异。P值<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 维生素E对大鼠骨量的影响

和对照组比较，模型组骨小梁明显减少，骨密度明显降低，表明老年大鼠骨流失严重；维生素E治疗组大鼠BMD明显高于模型组(P<0.05)。在股骨干骺端中，Micro-CT评估显示与模型组BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp对比，治疗组大鼠具有更高的BV/TV、Tb.Th、Tb.N和更低的Tb.Sp (P<0.05)。见图1。

图1 骨小梁Micro-CT扫描结果与定量分析结果注：A:骨小梁三维重建结果；B：BMD；C：Tb.Sp；D：Tb.Th；E：Tb.N；F：BV/TV；a：对照组；b：模型组；c：治疗组；Con:对照组；Mod:模型组；Tre:治疗组。与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。Fig.1 Micro CT scanning and quantitative analysis of trabecular bone

2.2 HE染色结果分析

对照组大鼠股骨干骺端可见大量骨小梁，骨小梁连接紧密且排列整齐；模型组干骺端只能见到很少量的骨小梁，骨小梁单独存在，之间几乎看不到连接，空白地方被大量脂肪空泡所替代；治疗组骨小梁组织较对照组明显增加，骨小梁之间连接疏松，但是较对照组明显改善。见图2。

图2 各组大鼠股骨干骺端HE染色观察结果注：A：对照组；B：模型组；C：治疗组；× 10。Fig.2 HE observation results of femoral metaphysis of rats in each group

2.3 维生素E对大鼠骨代谢的影响

与对照组相比，治疗组大鼠血清OC水平显著升高(P<0.05)，TRACP-5b水平降低(P<0.05)，见图3。

图3 两组大鼠血清OC和TRACP-5b水平比较注：A:OC;B:TRACP-5b；Con:对照组；Mod:模型组；Tre:治疗组。与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。Fig.3 Comparison of serum OC and TRACP-5b levels in two groups of rats

2.4 维生素E对SD大鼠自噬水平的影响

Western印迹分析显示维生素E治疗组大鼠Beclin-1和Atg 5的蛋白质表达更高。此外，维生素E还刺激LC3-II/LC3-I水平的改变(P<0.05)。同时，通过Western印迹证实维生素E处理降低了p62的表达(P<0.05)。所有结果均显示维生素E对年龄相关自噬水平的下降有保护作用。见图4。

图4 WB检测结果注：A：蛋白质印迹定量检测结果；B：LC3-II/LC3-I；C：Atg5；D：Beclin-1；E：p62蛋白的表达；Con:对照组；Mod:模型组；Tre:治疗组。与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。Fig.4 WB test results

3 讨论

本研究使用24月龄雌性大鼠作为研究模型，经过12周维生素E的干预治疗，HE和Micro-CT分析结果表明治疗组大鼠的骨密度及骨微观参数显著优于模型组；血清学的结果表明治疗组的成骨细胞活性增加，破骨细胞活性明显受到抑制。进一步研究产生这种可能性的机制，WB结果表明LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和Atg 5的蛋白质表达更高，p62表达显著降低。这表明骨组织中自噬水平明显增加，说明维生素E可以通过提高自噬水平来改善骨代谢和骨量。

选取24个月大的雌性SD大鼠作为研究模型，是因为老年雌性SD大鼠经历着与老年人相当的骨质流失。一些研究[8-9]已经证实，老年雌性SD大鼠可以作为年龄相关性骨丢失的合适动物模型。随着年龄的增长，骨吸收和骨形成之间的平衡受到干扰，骨吸收过多导致骨质流失[9]。然而，与年龄相关骨丢失的病理生理学的分子机制尚不完全清楚。据报道[10-11]，骨细胞是响应机械和激素刺激的骨重塑过程的主导者。一方面，骨细胞通过下调硬化蛋白来协调成骨细胞的形成，硬化蛋白通过激活Wnt信号传导是一种有效的骨形成抑制剂[12]；另一方面，在生理和病理条件下，骨细胞通过调节破骨细胞生成的促进剂RANKL的分泌来调节破骨细胞的活性[13]。凋亡的骨细胞被认为是与年龄相关的骨丢失的主要罪魁祸首。骨细胞凋亡导致的骨细胞死亡作为破骨细胞的归巢信号，从而促进局部骨吸收[14]。此外，凋亡的骨细胞能够释放表达RANKL的凋亡小体以募集破骨细胞[15]。因此，维持骨细胞活力的分子途径可能成为与年龄相关骨丢失的潜在治疗剂。本研究使用维生素E作为维持骨细胞活力干预手段，取得较好的疗效。

骨细胞可以经历称为自噬的细胞稳态机制。自噬被认为是维持细胞活力所必需的，细胞自噬的下降可能导致细胞死亡。以前的研究还报道自噬是一种重要的细胞凋亡保护过程。最近，已经证明自噬是骨细胞中一种主要的保护过程，可以抵抗糖皮质激素的有害影响[5]。此外，在啮齿动物中也观察到骨细胞自噬失败，而自体受损的遗传小鼠模型显示骨质减少和骨重建类似于衰老引起的[16]。上述结果表明，细胞自噬可能是保持骨细胞活力的重要机制，从而调节骨重塑。维生素E是脂溶性维生素之一，研究[17]证实其可以增加正常雄性大鼠骨量的作用。维生素E的机制之一是它具有清除自由基和防止氧化损伤的能力[18]。本研究表明在维生素E治疗的大鼠中观察到更高的自噬水平；维生素E治疗12周增加了骨细胞中特异性自噬体标志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和Atg 5表达。此外，维生素E还刺激了骨细胞富集的皮质骨中的LC3转化。此外，p62在经维生素E治疗的大鼠中显著降低，这表明治疗组的自噬活性明显增加。因此，本研究结果支持维生素E刺激骨细胞中的自噬活性的假设。以前的研究[18]表明，维生素E不仅能够减少破骨细胞数量，还能阻止破骨细胞的形成。所有上述观察结果表明，维生素E可以对年龄导致的骨量流失产生潜在影响。

当然，本研究也存在一定的局限性。首先，选取24月龄的雌性大鼠，由于个体的差异，可能影响研究结果；其次，没有使用阳性对照；最后，本研究中的维生素E只使用一种剂量，这种剂量是否为最佳剂量不得而知。

总的来说，本研究结果表明维生素E治疗显著提高了老年雌性大鼠血清骨钙素水平、降低了TRACP-5b水平，维生素E对骨重建影响的分子机制尚不清楚，但本研究证实维生素E在老年雌性大鼠中可以起到防止与年龄相关骨丢失的功效，通过增加自噬水平来保护老年雌性大鼠的骨量。