超声波在骨组织及骨髓活检中的应用

2016-09-06刘宪军吉林省吉林市中心医院病理科吉林吉林132011

中国现代医生 2016年11期

刘宪军吉林省吉林市中心医院病理科，吉林吉林　132011

超声波在骨组织及骨髓活检中的应用

刘宪军
吉林省吉林市中心医院病理科，吉林吉林132011

目的观察超声波在骨组织及骨髓活检中的应用效果。方法采用超声波作用下稀硝酸水浴加热后脱钙。结果脱钙充分，快速，保存了骨组织细胞病变的基本结构，时间短，效果好，可以进行连续切片，进行免疫组织化学染色，利于对骨疾病及骨髓病变的正确诊断。结论此种脱钙方法适宜标本量不大的基层医院推广使用，方法简单，容易掌握，解决了骨组织病理制片难题。

超声波；骨及骨髓活检；脱钙；切片

［Abstract］Objective To observe the app1ication effect of u1trasound in bone and bone marroe biopsy.Methods The samp1es were heated in di1ute nitric acid water bath and deca1cified under u1trasound.Results Deca1cification was fu11y comp1eted in a short time with favorab1e effect，and the basic structure of 1esion of bone ce11s was preserved.The samp1es were used for seria1 section and immunohistochemistry，which cou1d faci1itate correct diagnosis of bone and bone marrow 1esions.Conclusion This method for deca1cification can be promoted in primary hospita1s with sma11 samp1e size，because it is easy to 1earn and operate and so1ve the prob1em of making bone patho1ogica1 s1ide.

［Key words］U1trasound；Bone and bone marrow biopsy；Deca1cification；Section

骨组织是一种极坚硬的结缔组织，其主要成分是黏多糖、骨胶纤维及大量的无机钙盐羟基磷灰石晶体，其存在形式多为水合磷酸钙盐及少量碳酸钙盐［1］，在石蜡制片时无法切片，骨组织的生物学特性决定了制作骨组织病理切片时只有除去钙盐，使骨组织软化，并且保证骨组织病变的基本形态，才能进行病理石蜡制片［2］。实际工作中经常遇到因脱钙不充分或脱钙过度无法正常进行组织制片，我科室采用超声波作用下稀硝酸水浴加热，进行脱钙处理，取得了较好的效果，现报道如下。

1　材料与方法

1.1标本组织采集

标本采用我院2015年5～8月试验骨组织及骨髓活检组织。标本分为三组，第一组为骨肉瘤脱钙的骨组织10例；第二组为骨髓活检组织5例；第三组为骨肉瘤骨组织及骨髓活检组织各2例。

1.2试剂

脱钙剂（酸性较低的常规脱钙剂）为5%硝酸水溶液（硝酸5 mL，蒸馏水95 mL）；固定液为40%甲醛50 mL，甲醇100 mL，蒸馏水200 mL。

1.3方法

由于骨组织质地致密坚硬，并且含有骨胶等不易溶于水的有机成分，所以对骨组织的固定、脱水透明浸蜡都比较困难［3］，无论是苏木素伊红染色，还是特殊染色，免疫组织化学染色都必须将骨组织及时充分固定，只有将骨组织固定好，才能保存好骨组织的生物学结构特征，避免骨组织自溶，阻止细胞内分解酶的活性，防止丢失某些特殊的抗原。骨组织的固定基本上有先固定后脱钙，或者固定脱钙同时进行，或者先脱钙后固定［4］，但是多数科室都采用先固定后脱钙的方法。将骨组织锯成小方块，厚度不超过3 mm，骨髓组织按穿刺标本待用，用蒸馏水将40%的甲醛溶液配制成10%溶液，然后用它将甲醇配制成70%的小AF液（甲醇活性比乙醇强），将各组织取完材超声波充分水浴固定约30 min后水洗。然后打开超声快速组织处理仪，水温调到70℃，分两组烧杯各加入10%的稀硝酸溶液分别置于不同的超声磁头上水浴加热，并开始计时，20 min骨髓活检组织完成脱钙程序，60 min后可以使用大头针刺穿法观察骨肉瘤组织的脱钙程度，另一组混合骨组织常规操作，放在室温下观察。最后将上述完成脱钙的骨肉瘤组织及骨髓活检组织浸入自来水中10 min，完成脱钙步骤，然后进行常规石蜡的制片程序。

2　结果

2.1标本处理后结果

第一、第二两组骨组织由于5%的稀硝酸相对于以前使用的10%的稀硝酸酸性弱，且是在超声波作用下水浴加热，加速了骨组织钙离子与稀硝酸溶液的交换，脱钙充分，降低了硝酸对骨胶纤维及骨细胞骨架的破坏，保存了骨组织细胞病变的基本结构［5］，由于此种方法脱钙温柔，脱钙彻底，对骨髓组织破坏小、时间短、效果好，可以连续切片，进行免疫组织化学染色，利于对骨疾病及骨髓病变的正确诊断。尤其是对白血病等血液方面的疾病诊断更有比塑料包埋无法比拟的优势［6］，如上述的可连续切片、对组织破坏小等。第三组24 h后才进行常规石蜡制片程序。但是由于脱钙时间过长，导致硝酸大量残留，而使骨组织呈黄色，需要流水30 min的冲洗。见图1、2。

图1　平滑肌肉瘤脱钙实验制片效果（显微镜HE×4O染色）

图2　慢性粒细胞白血病急变实验脱钙效果（显微镜HE×4O染色）

2.2载玻片要求

所有含骨组织制片过程中，切片是重点，防止脱片也很关键。由于含有骨组织的蜡块骨组织硬，切片容易起毛毛刺，厚度不均，粘附力差，这是骨组织脱片的主要原因［7］。因此对于骨组织的载玻片要求洁净，透光度好，可以使用免疫组化的防脱载玻片。烤片温度应设置在80℃，贴附烘烤15 min，可以加速石蜡融化，充分从组织内融出，最大限度地降低烤片不彻底对下一步的影响。

2.3染色要求

如果骨组织脱钙充分，就没有膨胀现象；切片完整，无刀痕、破碎情况。苏木素伊红染色，应该加温，滴液染色，防止染色时掉片，示细胞核蓝色、胞浆红色，细胞轮廓清晰，色泽鲜艳，对比度强［8］。在骨组织的苏木素伊红染色过程中，每个制片步骤都应该加温进行，可以缩短全部过程的时间，也可以增强染色的效果。染色的温度控制在45℃水浴加热即可。免疫组化染色着色感强，易于抗原修复，抗原修复时温度不宜太高［9］，甚至可以脱完石蜡后直接进行免疫组化染色，以防掉片造成标本余量少而无法诊断。

2.4封片要求

无论脱钙的骨组织处理的如何理想，都不能像软组织一样粘附在载玻片上，因此需要封片树胶浓度大一点，免得二甲苯挥发后产生空壳切片，无法重新封片。

3　讨论

骨组织是一种有别于一般的软组织的极坚硬的结缔组织，其主要成分是黏多糖、骨胶纤维及大量的无机钙盐羟基磷灰石晶体，按照人体生理结构组成而特别坚硬［10］。骨组织的生物学特性，骨组织的生物学结构主要由骨细胞及骨基质构成，骨基质主要由胶原纤维、黏蛋白、无机羟基磷酸盐、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等各种有机物质及无机物质紧密连接而成，不同部位的骨组织由于其承受的功能不同其形态及活跃状态也不同，有的呈梭形、多边形、椭圆形及卵圆形等，因此对不同部位不同病变应该使用不同条件的脱钙方法［11］。骨组织虽然坚硬但是又具有生命活性，其存在形式多为水合磷酸钙盐及少量碳酸钙盐［12］，在石蜡制片时无法切片，骨组织的生物学特性决定了制作骨组织病理切片时只有除去钙盐，使骨组织软化，并且保证骨组织病变的基本形态，才能进行病理石蜡制片。实际工作中经常遇到因脱钙不充分或脱钙过度无法正常组织制片，就会出现组织过硬无法切片，造成切片撕裂、蹦丢组织、损坏刀片或骨组织形成骨泥失去了骨组织的病变特征，不能完整制成切片或失去了制片的目的。从各种文献报道对骨组织的脱钙处理方法很多，常用的有稀硝酸、混合酸、离子交换、电泳脱钙、微波技术脱钙等都有其存在的必要，在骨组织脱钙环节上均进行了深入探索，极大地改善了骨组织的切片质量，提高了骨组织苏木素伊红的生物学染色效果，同时在免疫组织化学、肿瘤荧光原位杂交等技术方面也有进一步的尝试［13］。

脱钙是各种骨组织常规制片过程的关键技术，对于甲状腺的钙化组织或骨组织常规制片都困难较大，特别是肋骨、颌骨、颅骨较硬的骨组织制片难度更大［14］。因此，要切出一张优质骨组织石蜡切片，前提是将骨组织进行充分固定，以保持骨组织细胞基本病变状态；然后选择一种对组织细胞破坏程度弱、适合常规染色及免疫组化染色的脱钙剂。以前工作中常选用10%硝酸水溶液，相对酸性强，促进离子交换单一，脱钙时间长，不易掌握，一般可达5～48 h，缩短脱钙时间有利于减少硝酸在骨组织内的残留，并且能完整保留骨组织及骨髓组织内的病变结构及组织成分，特别是对于骨组织恶性肿瘤及造血系统骨髓活检的免疫组织化学染色检查与诊断具有特殊意义。免疫组织化学染色是骨组织恶性肿瘤诊断必不可少的检查方法［15］，大大缩短了对骨组织疾病的诊断时间，提高了骨组织常规制片的效率。图1、图2所示骨小梁结构清晰，保留了骨组织的完整结构，HE染色细胞核，细胞仁着色力强，染色层次分明，切片薄厚均匀，无刀痕［16］。

综合上述实际工作中的应用，此方法制成的骨组织的片子组织结构清晰，不易断裂，结构完整，无刀痕，降低了骨性组织制片时间，达到了病理制片的基本要求，片子染色清晰，鲜明，利于诊断。此种脱钙方法适宜标本量不大的基层医院推广使用，方法简单，容易掌握，解决了骨组织病理制片难题。

［1］赵宝忠，张毅，刘志兰，等.病理组织脱钙液传统组方的比较分析［J］.临床与实验病理学杂志，2014，30（6）：699-702.

［2］胥维勇，杨群.脱钙方法与脱钙液的选择及应用［J］.组织化学与细胞化学杂志，2012，11（3）：263-264.

［3］陈明城，张伟，赖续文，等.改良脱钙液在骨骼组织切片中的应用［J］.中国误诊学杂志，2014，11（35）：8640-8641.

［4］王伯法，李玉松，黄高升，等.病理学技术［M］.北京：人民卫生出版社，2000：943.

［5］王伯法，李玉松，黄高升，等.病理学技术［M］.组织切片技术.北京：人民卫生出版社，2000：81-82.

［6］王晓萌，丁洋，王晓梅，等.一种简便快捷的骨及钙化组织脱钙液［J］.临床与实验病理学杂志，2011，27（5）：554-555.

［7］关凯，张立仁，郑永军，等.改良非脱钙骨塑料包埋、切片、染色方法［J］.临床与实验病理学杂志，2004，11（4）：280.

［8］杨传红，赖晃文，唐赓云，等.微波快速脱钙及其脱钙液的选择［J］.临床实验病理学杂志，1996，12（6）：357-359.

［9］黄进，钱源澄，沈国庆，等.应用微波辐射技术进行PAM染色的探讨［J］.临床与实验病理学杂志，1993，（3）：218-219.

［10］苏红，谷化平，熊正文，等.应用微波技术促进嗜触杆菌染色的方法［J］.临床与实验病理学杂志，1995，10（2）：167.

［11］陈世梁，卢志承，董玉英，等.介绍一种改良脱钙液在骨组织制片中的应用［J］.临床与实验病理学杂志，2009，25（5）：557-558.