芦荟素通过激活ERK1/2-Runx 2信号通路介导对去卵巢大鼠骨量流失的保护作用

沙仁高娃 陈华

1.青海大学附属医院妇科，青海 西宁 810000 2.青海大学附属医院肿瘤妇科，青海 西宁 810000

骨质疏松症是一种系统性骨骼疾病，其特征是骨量低和骨组织的微结构退化，导致骨骼脆弱和骨折风险增加[1]。骨质疏松症的主要原因是骨形成和骨吸收之间的不平衡，这是由成骨细胞的失活和破骨细胞活性的增加所致。目前主要预防和治疗骨质疏松的药物有两种：抗吸收药和促合成代谢药。由于双膦酸盐类药物具有减慢骨吸收的功效，因此它们被广泛用于治疗骨质疏松症，而包括人甲状旁腺素在内的合成代谢药物则可刺激骨形成。然而，长期使用这些药物会具有某些局限性和副作用[2-3]。芦荟素(LHS)是从常绿多年生植物芦荟中提取的蒽醌糖基化合物[4]，已被证明具有有效的抗肿瘤、抗炎、抗结肠炎和抗氧化活性[5-6]作用。最近的一项研究[6]发现，LHS可以在MC3T3-E1细胞中促进成骨分化调节因子的表达，例如BMP-2(骨形态发生蛋白2)和Runx 2(Runt相关转录因子2)。然而，尚未有LHS对绝经后骨质疏松症疗效的研究。因此，本研究的目的是使用LHS干预观察其对去卵巢大鼠骨量的影响，并初步探讨可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

将30只3月龄的雌性Sprague Dawley(SD)大鼠[(250±30) g，购于北京动物实验中心)]适应性饲养一周，随后对30只雌性大鼠进行双侧卵巢切除术(n=20)及假手术(n=10)。手术后大鼠被随机分为3组(每组10只)：去卵巢组(OVX)、假手术组(Sham)和去卵巢大鼠接受芦荟素治疗组(LHS)；其中LHS组大鼠每天接受50 mg/kg芦荟素(纯度>98%，购于Sigma-Aldrich)治疗，其余组大鼠接受生理盐水治疗。治疗12周后，处死所有动物收集双侧股骨进行检测。

1.2 方法

1.2.1Micro-CT检测：使用SkyScan 1076型号Micro-CT(SkyScan,Aartselaar,Belgium)对大鼠左侧股骨远端的松质骨骨小梁进行3D分析。Micro-CT设备包括一个焦点为9 μm的微型X射线管，可产生由电荷耦合器件阵列和转台检测到的扇形束，并可以沿轴向自动移动。选择能量和强度分别等于40 kVp和250 μA。在原始3D图像上，直接根据感兴趣的区域(VOI)确定形态计量指标，该体积仅限于直径为1.5 mm的内圆柱和整个股骨远端松质骨骨小梁，不包括距骺线2 mm远端的区域。通过计算以下3D形态参数来描述骨骼质量和微观结构：骨密度(BMD，g/cm2)、骨小梁厚度(Tb.th)、骨小梁体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。

1.2.2组织学检测：将右侧股骨在中性缓冲的10 %甲醛溶液中固定5 d，并在10 %乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)中脱钙1个月，然后用手术刀从矢状面中段分开并包埋在石蜡中。最后将样品在矢状面切成5 μm厚的切片，放在显微镜载玻片上，并用Van Gieson(VG)染色以进行光学显微镜检查。

1.2.3生物力学评估：使用Instron 4302系统对左侧股骨(每组n=5)进行三点弯曲实验评估。将股骨放在材料检测机支架上，两个支架之间的距离为1.5 mm，测试区域定义为股骨的最中央部分。以2 mm/min的速度施加压缩载荷直至骨折。通过连接的计算机监控骨折时的最大载荷(N)和弹性模量(mm2)的数据。

1.2.4蛋白印记检测：用RIPA缓冲液(Thermo Fisher Science)制备股骨远端骨组织裂解物，然后12 000g离心15 min以去除组织碎片。用BCA蛋白分析试剂盒(Beyotime)测定蛋白质浓度。在10 %或12 %十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶上分离总蛋白(20 μg)，并转移到聚偏氟乙烯膜上。在含有5 %脱脂奶粉的TBS中封闭1 h，然后在4 ℃下与p-Erk1/2、Erk1/2、ALP、RUNX 2、OCN和OPN (购于Cell Signing Technology)一抗体孵育过夜，最后用TBST清洗膜，并与二次抗体孵育1 h。使用ECL试剂 (Thermo Fisher Science)检测抗体反应条带，使用ImageJ软件定量分析条带强度。

1.3 统计学分析

统计分析采用单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Student’t检验。结果使用均数±标准差(SD)表示。P<0.05表示比较差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Micro-CT结果分析

股骨干骺端骨小梁二维图像如图1 A所示。股骨干骺端的微观参数如图1B～图1F所示。OVX组左侧股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th较Sham组明显降低，而Tb.Sp则明显升高(P<0.05)。LHS组左侧股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明显高于OVX组(P<0.05)，而Tb.Sp则明显低于OVX组(P<0.05)。

图1 三组大鼠股骨干骺端Micro-CT检测结果A：股骨干骺端骨小梁二维图像；B：骨密度；C：Tb.Th；D：Tb.N；E：Tb.Sp；F：BV/TV。注：与Sham组相比，*P<0.05;与OVX组相比，#P<0.05。Fig.1 Micro-CT test results of the femoral metaphysis in the three groups of rats

2.2 股骨组织病理学

股骨干骺端骨小梁组织切片如图2所示，Sham组大鼠股骨干骺端骨小梁致密，骨小梁网状结构正常；OVX组大鼠骨小梁疏松变薄，导致骨小梁间隙变宽；LHS组大鼠的骨小梁数量和连接增加明显，表现出明显的结构恢复。

图2 三组股骨的组织病理学a:Sham组;b:OVX组;c:LHS组。注：VG染色(放大倍数，×10)。Fig.2 Histopathology of femurs in the three groups

2.3 股骨的生物力学变化

股骨三点弯曲试验表明，Sham组的最大载荷和弹性模量均高于OVX组，两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，LHS组的最大载荷和弹性模量均高于OVX组(P<0.05)，见图3。

图3 右股骨的三点弯曲试验结果注：与Sham组相比，*P<0.05;与OVX组相比，#P<0.05。Fig.3 Three-point bending test results of the right femur of rats

2.4 WB检测结果

图4 WB检测结果A:WB检测各种蛋白的相对表达;B:RUNX 2;C:OCN;D:OPN;E:ALP;F:Erk1/2;G:p-Erk1/2。注：与Sham组相比，*P<0.05;与OVX组相比，#P<0.05。Fig.4 WB test results

和Sham组比较，OVX组p-Erk1/2、Erk1/2、ALP、RUNX 2、OCN和OPN表达水平明显下调，比较差异有统计学意义(P<0.05)。和OVX组比较，LHS组p-Erk1/2、Erk1/2、ALP、RUNX 2、OCN和OPN表达水平明显上调，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

芦荟素不仅具有促进伤口愈合的作用，还具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗过敏作用[5]。最近的研究[4]表明，芦荟素是RANKL诱导的RAW264.7细胞中破骨细胞生成和骨吸收的有效抑制剂，还可以通过MAPK和Wnt途径增强MC3T3-E1细胞的成骨性[4]。但是，芦荟素对绝经后骨质疏松症的作用目前尚不清楚。本研究的目的是研究芦荟素对去卵巢大鼠股骨骨强度、骨密度和骨小梁微观结构的影响。

Micro-CT结果显示，OVX组的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th最低，而TbSp最高。而芦荟素可以显著改善BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp。组织病理结果进一步证实了芦荟素可以改善骨小梁的微结构。以上结果表明，芦荟素可以显著增加去卵巢雌性大鼠的骨量，并改善其骨小梁的微结构。三点弯曲试验结果表明，去卵巢诱导的骨质疏松大鼠最大负荷和弹性模量均明显降低，芦荟素可以显著改善上述指标，并可以显著改善股骨的生物力学性能、增强其机械强度。

本研究进一步通过蛋白印记检测骨组织p-Erk1/2、Erk1/2、ALP、RUNX 2、OCN和OPN表达情况。在一项使用MC3T3-E1细胞系的研究[7]中，芦荟素在初始阶段通过增加ALP的产生并在后期阶段通过矿化来刺激成骨细胞的诱导过程。本研究表明芦荟素能促进骨组织中成骨相关基因(ALP、OCN和OPN)的表达。RUNX 2是成骨细胞分化和骨形成的关键调节剂，在骨髓间充质干细胞进入成骨细胞谱系的过程中起着重要作用；当受到连续的机械刺激或用热激蛋白70处理时，间充质干细胞可以被诱导成骨，这依赖于ERK1/2-Runx 2信号通路[8]。据报道，ERK1/2通路参与成骨的调节，成骨细胞分化过程中RUNX 2的稳定需要ERK1/2磷酸化[9]。为了确认ERK1/2途径是否参与芦荟素介导对去卵巢大鼠骨量保护作用，本研究进一步观察了芦荟素对骨组织ERK1/2表达情况。蛋白质印迹结果表明，在芦荟素干预的情况下，p-ERK1/2和RUNX 2表达水平显著上调。这些数据表明芦荟素能促进ERK1/2的磷酸化，进而上调转录因子RUNX 2的表达，从而促进成骨作用。

总之，本研究首次证明了芦荟素可以通过ERK1/2-Runx2信号通路促进去卵巢大鼠成骨，防止去卵巢大鼠骨量、骨密度和骨强度的降低。芦荟素可能成为治疗绝经后骨质疏松症的潜在药物。