雷公藤红素通过抑制颗粒细胞炎症因子基因表达改善肥胖小鼠生育能力的研究

宋东红，马利方，于洋

肥胖及其诱发的代谢紊乱已成为世界性公共卫生问题，特别是对女性生殖健康有负面影响，包括增加月经失调、无排卵和其他生育问题的风险［1-2］。此外，越来越多的证据表明，在超重或肥胖的不孕女性中，促排卵和辅助生殖技术（如体外受精）的成功率通常较低。肥胖增加了不孕症的治疗成本，患者需要使用更大剂量的促性腺激素［3-4］，且胚胎着床率和妊娠率降低［5-7］,流产风险增高［8］,接受辅助生殖助孕治疗的受孕率降低［9］。研究表明，肥胖患者胚胎质量下降与其颗粒细胞功能失调具有密切关系，改善其颗粒细胞功能，可以提高肥胖患者的卵母细胞和胚胎发育潜能［10-11］。

雷公藤红素是雷公藤等中药天然存在的一种五环三萜类的生物活性成分［12］，在中医领域用于治疗发热、关节疼痛、水肿及炎症，包括类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等［13］。近年来研究表明，雷公藤红素作为瘦素增敏剂可调节体质量，具有成为新型减肥药物的潜力，同时可以缓解肥胖导致的糖尿病胰岛素抵抗等病理表型［14］。但是，雷公藤红素能否直接作用于肥胖患者卵巢局部微环境，改善因肥胖导致的颗粒细胞功能失调，提高卵母细胞及胚胎发育潜能目前仍不清楚。本研究使用雷公藤红素干预肥胖小鼠模型，探讨其对颗粒细胞功能的影响，以及改善肥胖小鼠生育能力的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 实验动物SPF级CD-1小鼠均购自北京维通利华实验动物科技有限公司。其中雌性5周龄62只，体质量21.4～23.2 g；雌性8 周龄20 只，体质量27.2～28.5 g；雄性10周龄10只，体质量30.3～31.6 g；雄性结扎小鼠10周龄10只，体质量29.5～30.3 g。雷公藤红素（C0869）、细胞松弛素B（C6762）、体外操作液M2（M7167）、水合氯醛（23100）均购自美国Sigma公司，孕马血清促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素（宁波第二激素厂），透明质酸酶（美国Sigma 公司，H4272），总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司，AM1921），cDNA逆转录试剂盒（德国Qiagen 公司，205111），KSOMaa 培养基（德国Merck-Millipore公司，MR-020P-D），荧光定量PCR试剂盒（TIANGEN 公司，FP303-01），CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司，3111），体式显微镜（日本尼康，SMZ1000），倒置显微镜（日本尼康，Ti-E），显微操作系统（日本Narishige，NT-88-V3），显微注射系统（日本PRIME-TECH，PMM-150），实时荧光定量核酸扩增仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司，ABI 7900），纳米滴分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific 公司，NanoDrop2000），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司，Gel Doc XR），离心机（德国Eppendorf公司，5810）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 62只5周龄雌性CD-1小鼠采用抛硬币随机方法分为正常饮食组（n=26）、高脂饮食组（n=26）和雷公藤红素组（n=10）；正常饮食组和高脂饮食组再通过抛硬币随机方法分为正常饮食A组（n=10）、正常饮食B组（n=6）、正常饮食C 组（n=10），高脂饮食A 组（n=10）、高脂饮食B 组（n=6）和高脂饮食C组（n=10）。

1.2.2 肥胖小鼠模型的构建 正常饮食组小鼠喂食正常饲料；高脂饮食组和雷公藤红素组小鼠喂食高脂肪饮食（能量比：62%脂肪，18%蛋白质，20%碳水化合物）。高脂饮食组和雷公藤红素组小鼠体质量大于正常饮食组小鼠平均体质量20%时，被认为肥胖小鼠模型造模成功。所有动物被单笼饲养，环境温度为22～26 ℃，相对湿度为50%～60%，光暗周期为12 h/12 h，自由采食和饮水。6周后，对小鼠称质量并确定肥胖模型造模是否成功。本研究得到北京大学第三医院伦理委员会的批准，并遵守《实验动物护理和使用指南》。

1.2.3 雷公藤红素给药方法 用含5%二甲基亚砜（DMSO）和1%吐温20（Tween-20）的生理盐水溶解雷公藤红素粉末制备成的雷公藤红素使用液（含雷公藤红素500 mg/L）。雷公藤红素组按照100 μg/（kg·d）的标准［15］，每日下午4：00 采用灌胃方法给药，连续给药21 d。正常饮食C组与高脂饮食C 组同期以灌胃的方式给予等体积的含5% DMSO 和1%Tween-20的生理盐水。3组小鼠每日下午3：00称体质量。

1.2.4 交配实验检测小鼠产仔数 将正常饮食A 组与高脂饮食A组按照1∶1的比例，与10周龄雄性CD-1小鼠合笼，次日检查雌性小鼠阴栓。有阴栓的小鼠移入新笼中单独饲养，没有阴栓的小鼠继续合笼，直到检查到阴栓为止。19.5 d 产仔后，记录产仔数。

1.2.5 小鼠颗粒细胞及卵母细胞收集 正常饮食B组、高脂饮食B组、正常饮食C组、高脂饮食C组和雷公藤红素组小鼠（其中正常饮食C 组、高脂饮食C 组和雷公藤红素组6 只小鼠，均采用抛硬币随机分组方法，从每组10只小鼠中随机抽取）腹腔注射10 IU 孕马血清促性腺激素（PMSG），48 h 后腹腔注射10 IU 人绒毛膜促性腺激素（hCG）。注射hCG 后14～16 h，处死小鼠，取出输卵管，显微镜下划开壶腹部收集卵母细胞—卵丘颗粒细胞复合物。将卵母细胞—卵丘颗粒细胞复合物置于1 mg/L透明质酸酶中3 min，直到卵丘细胞分散。将散落在透明质酸酶中的卵丘颗粒细胞转移到1.5 mL 试管中，在200×g 条件下离心5 min，去除上清液，将细胞悬浮在KSOMaa培养基中，在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2.6 实时荧光定量PCR（qPCR）法检测小鼠颗粒细胞基因表达水平 使用RNA 分离试剂盒从1.2.5中5组小鼠颗粒细胞中提取总RNA。使用纳米滴分光光度计测定分离RNA的浓度和质量。用cDNA逆转录试剂盒合成目的基因cDNA，利用荧光定量PCR 仪检测目的基因的表达。用GADPH 作为PCR 内对照。PCR 反应体系的扩增条件：95 ℃变性120 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循环40次。用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达。所有实验至少重复3次。检测的目的基因包括：B 细胞淋巴瘤-2 相关X 蛋白编码基因（Bax）、BCL2拮抗/杀伤因子1（Bak1）、FAS相关死亡结构域蛋白编码基因（Fadd）、肿瘤坏死因子受体相关因子2（Traf2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（Casp8）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Casp 9）、细胞色素P450-家族11-亚家族A-肽1（Cyp11a1）、细胞色素P450-家族19-亚家族A-肽1（Cyp19a1）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6。其中Bax、Bak1、Fadd、Traf2、Casp8和Casp9反映颗粒细胞凋亡情况，Cyp11a1 和Cyp19a1 反映雌激素合成情况，IL-1β 和IL-6 反映颗粒细胞炎症反应激活情况。引物序列见表1。

1.2.7 小鼠胚胎发育情况检测 取10周龄CD-1雄鼠，断颈法处死后从附睾中取出精子，放入含有5 mg/L 细胞松弛素B的M2 体外操作液中。用注射针吸取一个精子，注射入小鼠卵母细胞中。注射后的卵母细胞放入KSOMaa培养液中继续培养。6 h后，在200倍倒置显微镜下观察出现原核的受精卵数量，统计受精率（受精率=原核受精卵数÷卵母细胞总数×100%）。24 h后在200倍倒置显微镜下观察2细胞胚胎数量，统计卵裂率，卵裂率=卵裂胚胎数÷卵母细胞总数×100%。3.5 d 后在200 倍倒置显微镜下观察囊胚数量，统计囊胚率，囊胚率=囊胚数÷卵母细胞总数×100%。

1.2.8 胚胎移植 将8 周龄的CD-1 雌鼠与10 周龄CD-1 结扎雄鼠合笼交配，次日检查阴栓。将具有阴栓的雌鼠单独饲养2 d，即为假孕2.5 d 的小鼠，待用。移植当天，给小鼠腹腔注射4%水合氯醛，麻醉后，剪开皮肤和肌肉层，暴露出子宫，利用玻璃针将囊胚移入假孕2.5 d小鼠的子宫中，17.5 d仔鼠出生后，计算产仔数，产仔数与移植囊胚数的比值即为出生率。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0 统计软件进行统计分析。定量数据均采用±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t 检验。P＜0.05为差异有统计意义。

2 结果

2.1 肥胖对小鼠产仔数及颗粒细胞相关基因表达的影响 高脂饮食A 组小鼠11 周龄体质量显著高于正常饮食A组（P＜0.01），每窝平均产仔数显著低于正常饮食A 组（P＜0.01），见表2。与正常饮食B组比较，高脂饮食B 组小鼠颗粒细胞IL-1β、IL-6、Bax、Bak1、Fadd、Traf2、Casp8、Casp9表达显著升高，而Cyp11a1和Cyp19a1表达显著降低（均P＜0.01），见表3。

Tab.2 Effects of normal and high-fat diet on the body weight and litter size of mice表2 正常饮食与高脂饮食对小鼠体质量及产仔数的影响（n=10，x±s）

Tab.3 Effects of normal and high-fat diet on the gene expression levels of mouse granulosa cells表3 正常饮食与高脂饮食对小鼠颗粒细胞相关基因表达的影响 （n=6，x±s）

2.2 雷公藤红素对肥胖小鼠颗粒细胞相关基因表达的影响 雷公藤红素组与高脂饮食C组小鼠体质量差异无统计学意义，见表4。与高脂饮食C组相比较，雷公藤红素组小鼠颗粒细胞IL-1β、IL-6、Bax、Bak1、Fadd、Traf2、Casp8、Casp9表达显著降低（P＜0.01），而Cyp11a1和Cyp19a1表达显著升高（P＜0.01）。与正常饮食C组小鼠相比，雷公藤红素组小鼠颗粒细胞Il-1β、Il-6、Bax、Bak1、Casp8、Cyp11a1和Cyp19a1表达差异无统计学意义（P＞0.05），而Fadd、Traf2、Casp9表达显著升高（P＜0.05），见表5。

Tab.4 Effects of celastrol diet on the body weight of mice in normal,high-fat and celastrol-diet groups表4 喂食雷公藤红素对正常饮食、高脂饮食和雷公藤红素组小鼠体质量的影响 （n=10，x±s）

2.3 雷公藤红素对小鼠生育能力影响 雷公藤红素组和正常饮食C组小鼠排卵数、卵裂率、囊胚率和出生率均显著高于高脂饮食C组（P＜0.05），雷公藤红素组和正常饮食C 组差异无统计学意义。3 组小鼠受精率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表6。

Tab.5 Effects of celastrol diet on the gene expression levels of mouse granulosa cells in normal,high-fat and celastrol-diet groups表5 喂食雷公藤红素对正常饮食、高脂饮食和雷公藤红素组小鼠颗粒细胞基因表达的影响（n=6，x±s）

Tab.6 Effects of celastrol diet on the ovulation,fertilization,embryonic development and birth rate of mice in normal,high-fat and celastrol-diet groups表6 喂食雷公藤红素对正常饮食、高脂饮食和雷公藤红素组小鼠排卵、受精、胚胎发育及出生率的影响（n=6，x±s）

3 讨论

3.1 肥胖与女性不孕 肥胖是导致女性内分泌失调，进而诱发不孕症的主要因素之一。临床研究表明，肥胖女性的激素分泌异常表现为雌激素水平显著升高，而孕激素水平显著降低［16］。同时，肥胖女性的流产率增加［8］，即便在采用辅助生殖助孕技术后，其胚胎发育率、优质胚胎率仍然较非肥胖患者显著降低［5-6，9］。目前，临床上针对肥胖不孕症患者仍然以降低体质量、调节机体内分泌等整体治疗为主，而缺乏对改善卵巢局部功能的治疗方式的深入探索。本文探究了一种具有多种生物活性的天然产物雷公藤红素对小鼠卵巢颗粒细胞的作用，结果显示雷公藤红素能够通过调控炎症因子基因的表达，改善颗粒细胞的凋亡与激素合成相关基因的表达模式，进而提高小鼠生育能力。

3.2 肥胖引起颗粒细胞炎症、凋亡及对雌激素合成基因表达的影响 颗粒细胞是女性卵巢内重要的细胞类型之一，其不仅为卵母细胞发育提供必须的代谢产物，同时也是雌激素和雄激素的重要合成场所。既往研究表明，肥胖女性体内炎症基因水平增高，机体处于慢性炎症状态［17］。本研究检测小鼠卵巢颗粒细胞中炎症因子基因IL-1β和IL-6的表达水平，发现高脂饮食组小鼠颗粒细胞中两个炎症因子基因的编码基因表达水平显著上调，提示肥胖可诱导颗粒细胞产生炎症反应。在肿瘤等疾病中，炎症反应已被证实可以诱导细胞凋亡［18］。本研究中，细胞凋亡相关基因Bax、Bak1、Fadd、Traf2、Casp8与Casp9的表达水平在高脂饮食组小鼠颗粒细胞中均显著上调，提示肥胖可诱导颗粒细胞发生细胞凋亡。细胞凋亡主要通过两种方式进行，即线粒体途径和死亡受体途径。Bax、Bak1和Casp8属于线粒体途径的凋亡相关分子，而Fadd、Traf2和Casp9属于死亡受体途径的凋亡相关分子。本研究提示，高脂饮食诱导的肥胖会同时通过两条经典细胞凋亡途径诱导颗粒细胞发生凋亡。Cyp11a1和Cyp19a1是雌激素合成过程中重要的限速酶的编码基因，其表达量的降低可导致雌激素分泌水平降低。本研究结果表明，高脂饮食组小鼠Cyp11a1和Cyp19a1基因表达水平显著下调，这与既往研究结论一致［19-20］。以上研究结果说明，肥胖会通过诱发颗粒细胞促炎因子的表达，激活颗粒细胞的炎症反应，诱导颗粒细胞凋亡，同时降低颗粒细胞激素合成限速酶编码基因表达水平，影响颗粒细胞的激素分泌功能，进而导致肥胖小鼠产仔数的降低。

3.3 雷公藤红素可改善肥胖小鼠颗粒细胞功能并提高其生育能力 本研究发现，对高脂饮食小鼠喂食雷公藤红素后体质量没有显著降低，这与既往研究结果不同。近年来，雷公藤红素已经在多项研究中被发现可以作为瘦素增敏剂来有效降低肥胖小鼠的体质量［21］。本研究与既往研究的这种差异可能来自于喂食雷公藤红素的持续时间不同。既往研究中，小鼠需要喂食2个月，大鼠喂食6周后，体质量方能显著降低［22-23］，而本研究仅喂食21 d。尽管体质量没有下降，但是本研究发现雷公藤红素可以通过作用于卵巢局部，降低颗粒细胞炎症因子基因的表达，提高颗粒细胞激素合成限速酶编码基因表达水平，改善颗粒细胞的雌激素分泌功能。本研究还发现，雷公藤红素组小鼠颗粒细胞中Bax、Bak1和Casp8的表达被显著抑制，而Fadd、Traf2和Casp9的表达仍然显著增高，提示雷公藤红素通过抑制线粒体凋亡途径，而不是死亡受体凋亡途径来改善颗粒细胞的功能。这可能与雷公藤红素具有较强的抗氧化应激能力有关，有研究证明雷公藤红素可以对线粒体发挥作用［24］，而线粒体是炎症反应发生的重要细胞器之一。与雷公藤红素具有相似功能的二甲双胍和白藜芦醇，已经被证明可以通过保护颗粒细胞线粒体功能，抑制炎症反应，改善多囊卵巢综合征女性的生育力［25］，这也为本研究发现的雷公藤红素可以通过抑制细胞凋亡和炎症，改善肥胖小鼠生育力提供了佐证。

综上所述，本研究初步证实肥胖可以诱导雌性小鼠卵巢局部的颗粒细胞炎症因子基因表达异常，诱发颗粒细胞凋亡，降低颗粒细胞的雌激素分泌功能，进而导致生育能力降低。雷公藤红素在不降低体质量的情况下，即可通过抑制卵巢局部颗粒细胞的炎症反应和线粒体凋亡途径的激活，上调颗粒细胞激素合成限速酶编码基因表达水平，改善颗粒细胞的雌激素分泌功能，改善肥胖小鼠模型的生育能力。由于炎症反应和细胞凋亡是通过多种细胞通路进行调控，雷公藤红素改善颗粒细胞激素分泌功能的具体分子机制仍然有待进一步探索。