原花青素B2 对猪颗粒细胞氧化损伤的保护作用及机制研究

邢宝松，张家庆，任巧玲，吕玲燕，王献伟，陈俊峰，高彬文，马 强

（1. 河南省农业科学院畜牧兽医研究所/河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002；2. 广西壮族自治区畜牧研究所，广西 南宁 530001；3. 河南省畜牧总站，河南 郑州 450008）

氧化应激（Oxidative stress，OS）是指机体在遭受各种有害刺激时，体内自由基的产生与抗氧化防御系统之间严重失衡，引起动物细胞和组织氧化损伤的现象[1]。自由基中对机体危害最大的为活性氧（Reactive oxygen species，ROS）[2]。在正常生理状态下，ROS 作为第二信使在细胞信号传导和基因表达调控中具有重要作用[3]。然而，在现代畜禽养殖过程中，许多外源或内源刺激（空气质量、饲养密度、冷热应激、束缚应激、妊娠、泌乳、霉菌毒素、疾病等）均可导致机体内ROS 水平急剧增加，诱发氧化应激。因此，OS常被认为是影响动物健康和繁殖性能的重要因素[4]。

颗粒细胞（GC）是卵巢中十分重要的功能细胞，其增殖与分化直接影响着卵泡的发育、排卵以及激素分泌等功能活动[5]。大量研究表明，卵巢氧化应激显著促进了颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁，并且发现，卵泡液中ROS 增加或抗氧化能力降低引起卵母细胞质量下降，导致受精率降低，甚至还会引起一系列并发症，如胎儿生长受限，流产、早产、弱仔率增高等[6-8]。相反，通过补充抗氧剂可抑制卵泡中ROS 的产生与活性，同时能够显著减轻由OS 引起的颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁的发生[9-10]。

原花青素（OPC）是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂[11-12]。研究表明，OPC 抗自由基氧化能力是维生素E 的50 倍、维生素C 的20倍[13]。近年来，有关OPC 的生理活性和药用价值已进行了大量研究，发现OPC 具有重要作用，如抗氧化、抗炎活性、抗衰老、促进伤口愈合和组织修复等[14]。鉴于此，为了进一步证实OPC 拮抗猪颗粒细胞氧化损伤的能力，采用过氧化氢（H2O2）制备猪颗粒细胞氧化损伤模型，研究OPC 对猪颗粒细胞氧化损伤的保护作用，以期阐明OPC 抗猪颗粒细胞氧化损伤的作用机制，旨在为其进一步开发利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

原花青素B2（GSPB2）购自美国Sigma 公司；DMEM/F12 培养基、胎牛血清购自美国GIBCO 公司；胰酶、DAPI 购自北京索莱宝科技有限公司；Trizol Reagent、TaqDNA 聚合酶和RT-PCR 试剂盒购TaKaRa 公司；ROS 试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司；H2O2（30%，AR 级）购自上海国药集团化学试剂有限公司；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自碧云天生物技术公司；细胞凋亡检测试剂盒购自罗氏公司；细胞增殖检测试剂盒（MTT），过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；p16 和Stir1 抗体购自Abcam 公司；p21 抗体购自Proteintech公司。

1.2 试验材料

试验所用卵巢采自郑州市肉联屠宰场，卵巢来自体质量为（120±5）kg 的三元母猪。母猪屠宰后，根据卵泡发育状况采集处于卵泡期且发育良好的卵巢，去掉系膜等残余组织立即放入37 ℃生理盐水的保温杯，于2～3 h 内送至实验室。卵巢运送到实验室后将100 U/mL 青霉素和50 mg/L 链霉素添加至预热生理盐水（37 ℃）进行洗涤3 次。然后将卵巢放于37 ℃灭菌的生理盐水中置于水浴锅内。

1.3 颗粒细胞分离与培养

使用20 mL 注射器抽取直径为3～5 mm 的健康卵泡内的颗粒细胞，将抽吸的卵泡液与颗粒细胞放置于50 mL 离心管内，在37 ℃水浴锅中自然沉降10～15 min，1 000 r/min 离心5 min，然后利用注射器缓慢吸取上清后，利用PBS 清洗颗粒细胞2 次，1 000 r/min 离心5 min，去除PBS。然后将预热的DMEM/F12+10% 胎牛血清（FBS）培养基（含100 U/mL 青霉素和50 mg/L 链霉素）1～3 mL 添加至颗粒细胞中，使用携带1 mL枪头的移液器充分吹打颗粒细胞至完全散开。调整好所需细胞密度后，接种于T25 培养瓶，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。24 h 后观察颗粒细胞贴壁情况，去除培养基、卵母细胞及未贴壁的颗粒细胞，PBS清洗一次，更换培养基继续培养，待细胞长至90%汇合度时进行传代，用于后续相关研究。

1.4 试验设计

试验分3 组：（1）空白对照组（CK），换DMEM/F12+5%FBS 培养基继续培养；（2）氧化应激组（H2O2），换DMEM/F12+5%FBS 培养基24 h 后，加入终浓度为200 μmol/L H2O2培养12 h；（3）GSPB2+H2O2组，换DMEM/F12+5%FBS 培养基，不同浓度的GSPB2预处理24 h后加H2O2孵育12 h。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 细胞活力分析 取对数生长期的颗粒细胞，每孔2 000 个接种于96 孔板，在37 ℃、5% CO2培养24 h 后，按分组要求给予不同因素的处理，每组设6个平行孔，培养结束后，每孔加入20 μL的MTT，继续培养4 h，吸出培养基，每孔加入150 μL DMSO，室温振摇10 min，然后在酶标仪490 nm 处测定每孔的OD值，取其6孔的平均值，计算细胞的存活率。

1.5.2 细胞凋亡测定 各组细胞爬片用PBS 清洗3次，4%多聚甲醛固定。采用缺口末端标记法（TUNEL 法）检测各组细胞凋亡。相关操作按照罗氏细胞凋亡试剂盒说明书进行。荧光显微镜观察，细胞核内出现凋亡小体（细胞核中呈现绿色小体）即为TUNEL 阳性细胞。选取猪颗粒细胞分布均匀的视野，在荧光显微镜下选择5个视野，记录凋亡的细胞数量，计算凋亡细胞率。

1.5.3 ROS 活性分析 各组细胞爬片用PBS 清洗3次，采用GENMED 细胞内氧化应激ROS 红色荧光试剂盒检测各组细胞内ROS 活性。相关操作按试剂盒说明书进行，使用倒置荧光显微镜检测细胞ROS 活性，在荧光显微镜下记录5 个视野中的细胞数量，采用Image J软件测定荧光强度。

1.5.4 氧化应激指标测定 利用移液器吸去各组细胞的培养液，PBS 洗涤细胞3 次，利用细胞刮刀刮下细胞后，立即放入预冷的PBS中，在4 ℃条件下离心沉淀，冰浴中利用超声破碎细胞，分别测定不同处理组颗粒细胞内CAT、SOD、GSH-Px 活性及MDA含量，测定方法参照试剂盒说明书。选取不同处理组颗粒细胞，应用β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测衰老细胞。

1.5.5 定量PCR 检测和Western blot 分析 利用TaKaRa 公司反转录和定量试剂盒进行反转录和定量PCR 检测，严格按照说明书进行操作。本研究中所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物详细信息见表1。收集各组颗粒细胞，提取总蛋白质，进行Western blot 分析，采用Image J 软件进行分析Sirt1、p16和p21蛋白的相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR所用引物Tab.1 Primers for real-time fluorescence quantitative PCR

1.6 数据处理

所有数据均以平均值±标准差表示，采用SPSS 18.0 统计软件进行分析。均值比较采用单因素方差分析，差异显著水平为P＜0.05，差异极显著水平为P＜0.01。

2 结果与分析

2.1 H2O2和GSPB2对猪颗粒细胞存活率的影响

利用H2O2处理猪颗粒细胞诱导细胞体外氧化应激损伤模型。如图1A 所示，颗粒细胞在不同浓度（50、100、200、300、500、1 000 μmol/L）H2O2作用12 h 后，随着H2O2浓度的升高，颗粒细胞的活力逐渐下降。与对照组相比，200 μmol/L H2O2处理12 h，颗粒细胞活力极显著降低（P＜0.01）。如图1B所示，用不同浓度（1、5、10、25、50、100 μmol/L）的GSPB2预处理猪颗粒细胞24 h，GSPB2浓度在1～25 μmol/L对颗粒细胞无毒性，但当浓度超过50 μmol/L 时对细胞表现出了毒性作用。因此，选取1～25 μmol/L作为后续试验使用浓度。如图1C 所示，GSPB2（10、25 μmol/L）预处理24 h能显著提高由H2O2损伤的颗粒细胞存活率（P＜0.05）。

2.2 GSPB2 对H2O2诱导猪颗粒细胞ROS水平和凋亡的影响

细胞内氧化应激活性（ROS）红色荧光检测结果见图2A 和图2B。与对照组相比，H2O2模型组（200 μmol/L）细胞内ROS 水平显著升高（P＜0.05）；与H2O2模型组相比，GSPB2 组（10 μmol/L）细胞内ROS水平显著降低（P＜0.05）。采用TUNEL 方法检测颗粒细胞凋亡，结果见图2C 和图2D。与对照组相比，H2O2模型组（200 μmol/L）凋亡细胞率明显增加（P＜0.05）；与H2O2模型组相比，GSPB2 组（10 μmol/L）凋亡细胞率显著降低（P＜0.05）。上述结果表明，GSPB2 可通过抑制颗粒细胞ROS 水平和凋亡来保护H2O2诱导的猪颗粒细胞氧化应激损伤。

2.3 GSPB2对H2O2损伤猪颗粒细胞内氧化应激指标的影响

如图3A—D 结果所示，H2O2诱导的氧化应激可引起猪颗粒细胞SOD、GSH-Px 及CAT 活性明显降低（P＜0.05）；与H2O2模型组（200 μmol/L）相比，GSPB2 预处理后颗粒细胞内SOD、GSH-Px 及CAT活性明显升高（P＜0.05）。与对照组相比，H2O2模型组（200 μmol/L）颗粒细胞中MDA 含量明显增高（P＜0.05）；与H2O2模型组相比，GSPB2（10 μmol/L）预处理后颗粒细胞中MDA 含量显著降低（P＜0.05）。上述结果表明，GSPB2 能显著增强颗粒细胞内抗氧化酶的活性和降低过氧化脂质含量，从而增强颗粒细胞清除自由基的能力。

图3 GSPB2对H2O2损伤猪颗粒细胞内氧化应激指标的影响Fig.3 Effects of GSPB2 on oxidative stress indexes in H2O2-injured PGCs

2.4 GSPB2对H2O2损伤猪颗粒细胞内相关基因表达的影响

定量PCR 分析结果（图4）显示，猪颗粒细胞经H2O2（200 μmol/L）处理12 h，Bcl-2/Bax比值、Sirt1的mRNA 水平与对照组相比明显下降，Caspase3、Bim、Fas和Puma的mRNA 水平显著升高（P＜0.05）。与H2O2模型组（200 μmol/L）相比，GSPB2（10 μmol/L）预处理后颗粒细胞内相关基因的mRNA 表达水平具有显著改善作用（P＜0.05）。这表明GSPB2 可能是通过调控Sirt1及凋亡相关基因的表达减缓了H2O2诱导的猪颗粒细胞氧化损伤。

图4 GSPB2对H2O2损伤猪颗粒细胞内相关基因表达的影响Fig.4 Effects of GSPB2 on expression of related genes in H2O2-injured PGCs

2.5 GSPB2 对H2O2诱导猪颗粒细胞衰老的保护作用

β-半乳糖苷酶检测分析（图5A）表明，猪颗粒细胞经H2O2（200 μmol/L）处理12 h，颗粒细胞中β-半乳糖苷酶活性与对照组相比显著提高（P＜0.05）。与 H2O2模型组（200 μmol/L）相比，GSPB2（10 μmol/L）预处理24 h 后，颗粒细胞内β-半乳糖苷酶活性显著降低（P＜0.05）。Western blot分析结果显示（图5B、5C），与对照组相比，H2O2（200 μmol/L）处理猪颗粒细胞24 h 后，Sirt1 蛋白表达量明显下调，p16 和p21 蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。用10 μmol/L 的GSPB2 预处理24 h 后，Sirt1 蛋白表达量明显上调，p16 和p21 蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。以上结果表明，GSPB2 可能是通过调控Sirt1、p16 和p21 蛋白的表达，减缓了氧化应激诱发的猪颗粒细胞衰老。

图5 GSPB2对H2O2诱导猪颗粒细胞衰老的保护作用Fig.5 Protective effect of GSPB2 on senescence of PGCs induced by H2O2

3 结论与讨论

本研究采用H2O2处理猪卵巢颗粒细胞，建立颗粒细胞体外氧化应激损伤模型，添加GSPB2 进行干预，探索其缓解颗粒细胞氧化损伤的分子靶点及其作用机制。H2O2诱导的猪颗粒细胞氧化应激可使细胞存活率显著降低，而添加不同浓度的GSPB2 预处理后可提高颗粒细胞活力，抑制H2O2诱导的猪颗粒细胞氧化损伤作用。TUNEL 和ROS 检测结果表明,用低浓度的GSPB2 预处理猪颗粒细胞再进行氧化应激处理，颗粒细胞凋亡率和ROS 水平显著降低。

SOD 是机体内自由基的头号杀手，能快速将体内有害自由基分解成无害的水分子和氧分子从而消除组织细胞脂质过氧化[15-17]。GSH-PX 是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，可使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能免受过氧化物的损害[11]。CAT存在于细胞的过氧化物体内，主要职责是催化过氧化氢分解成氧和水[12]。MDA 是机体内氧自由基代谢中产生的脂质过氧化产物，间接反映组织细胞的损伤情况[6]。本研究结果表明，GSPB2 可拮抗H2O2引起的猪颗粒细胞中SOD、GSH-PX和CAT活性降低，以及MDA 含量的升高，这表明GSPB2 具有清除颗粒细胞氧自由基和抗脂质过氧化作用，其作用在一定范围内呈剂量依赖性。

Sirt1 蛋白是组蛋白脱乙酰化酶Ⅲ家族成员，参与多种细胞生理过程。大量研究表明，Sirt1 蛋白在氧化应激诱导的细胞损伤中起重要调控作用[18]。GAY 等[19]报道，Sirt1 蛋白表达水平在神经元细胞氧化损伤中显著下调；王飞清等[20]研究发现，Sirt1基因在衰老雌鼠卵巢中的表达量显著下调。p21 蛋白是一种重要的细胞周期调控蛋白，参与细胞的生长、分化、衰老及死亡过程[21]。p16 蛋白是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，在细胞衰老中发挥了重要的作用[22]。研究发现，在氧化应激诱导的细胞衰老中，多种信号转到途径都涉及p16和p21基因表达的改变[23]。本研究在猪颗粒细胞体外氧化损伤中也发现，200 μmol/L H2O2处理12 h 可诱发猪颗粒细胞氧化损伤，同时Sirt1 蛋白表达下调，p16 和p21 蛋白表达上调；而补充GSPB2 再经H2O2处理，Sirt1、p16 和p21 的表达显著抑制，表明GSPB2 具有抗颗粒细胞氧化损伤和延缓衰老的作用。

综上所述，GSPB2 可有效抑制H2O2诱导的猪颗粒细胞氧化损伤，降低了凋亡数量。GSPB2 可能是通过提高Bcl-2/Bax表达比例，上调Sirt1 蛋白表达，下调p16 和p21 蛋白的表达，抑制颗粒细胞氧化损伤及衰老。