尼克酰胺-N-甲基转移酶在肺腺癌间质中的表达及其生物学功能

鞠薇薇，于生金，林黎娟，邵志翔，张奇芳，江黎黎△

肺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下［1］。寻找肺癌早期标志物以及预后指标将有助于早期诊断，并为治疗提供新思路。尼克酰胺-N- 甲基转移酶（nicotinamide Nmethyltransferase，NNMT）是人体内重要的甲基化酶，可以催化尼克酰胺和其他吡啶衍生物的甲基化，并参与多种化合物的生物转化［2］。正常人体内NNMT 主要在肝脏内表达，但越来越多的研究发现NNMT 在皮肤肿瘤［3］、胶质瘤［4］、胰腺癌［5］、胃癌［6］和肠癌［7］等多种肿瘤组织中异常表达。上述研究仅关注了NNMT在肿瘤细胞中的表达和功能。最近有文献报道了卵巢癌间质肿瘤相关成纤维细胞（cancerassociated fibroblasts，CAF）中的NNMT 可以显著促进卵巢癌的恶性进展［8］。NNMT 在其他肿瘤间质中是否也有表达及相似功能尚不明了。本研究通过体内和体外实验探讨肺腺癌间质细胞中NNMT的表达与肿瘤恶性进展及患者预后的关系，以期为深入研究NNMT在肺腺癌中的作用提供实验基础和思路。

1 资料与方法

1.1 标本来源 搜集丹东市第一医院2010年1月—2013年12 月收治的150 例肺腺癌患者手术切除的组织标本。纳入标准：（1）患者术前均未经放化疗及其他治疗。（2）手术后组织病理结果为肺腺癌。患者年龄38～86岁，中位年龄60岁；男89 例，女61 例；TNM 临床分期Ⅰ～Ⅱ期105 例，Ⅲ～Ⅳ期45例。本研究得到本院伦理委员会批准，并且所有患者均签署知情同意书。对纳入患者采用电话、查阅病历和写信等方式进行随访，随访截止时间为2019 年6 月，随访时间4～96 个月，中位随访时间77个月，随访信息完整者共101例。

1.2 细胞及试剂 人肺成纤维细胞HLF-1及肺腺癌细胞系A549 和PC9 购自美国模式菌种收集中心（ATCC），兔抗人NNMT多克隆抗体（ab223513）、内参β-actin抗体（ab8226）购自英国Abcam 公司，免疫组化专用一抗稀释液、辣根过氧化物酶标记通用二抗（PV-6000）及DAB 显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。细胞培养所用胎牛血清和培养液购自美国Gibco 公司。过表达NNMT 质粒、对照质粒及慢病毒载体委托上海吉凯基因公司合成并包被。TRIzol试剂购自美国Invitrogen 公司，SYBR Green PCR 试剂购自日本TaKaRa 公司。Alexa fluo594（A-11012）购自美国Thermo公司；CCK-8 试剂盒、RIPA 细胞裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 免疫组化染色检测腺癌组织中NNMT 表达 染色采用SP二步法，组织切片常规脱蜡水化，高压修复暴露抗原，双氧水孵育去除内源性过氧化物酶，兔抗人NNMT 一抗（1∶200）4 ℃孵育过夜，免疫组化通用二抗室温孵育1 h，DAB 显色2 min。免疫组化结果判断：综合考虑阳性细胞数和阳性强度，采用半定量方法，依据阳性细胞比例［0 分（0%），1 分（1%～25%），2 分（26%～50%），3 分（51%～75%）及4 分（76%～100%）］和着色强度［0分（无着色），1分（淡黄色），2分（棕黄色）及3分（棕褐色）］，将2个分值相乘，每张切片于热点区域随机读取10个高倍视野，对肿瘤细胞和肿瘤间质分别进行评分。最后按评分结果将所有病例标本划分为2组，0～4分为低表达组，5～12分为高表达组。

1.4 稳定表达NNMT 细胞系的构建及鉴定 人肺成纤维细胞HLF-1 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基培养于37 ℃、5%CO2培养箱中。实验设过表达NNMT 质粒（NNMT组）和对照质粒（control组）。提前24 h将HLF-1细胞接种至6孔板，按照感染复数计算所需病毒量，然后将NNMT过表达质粒及对照质粒分别感染对数生长期的HLF细胞；48 h后用1 mg/L 嘌呤霉素筛选细胞，最终获得稳定表达NNMT 的HLF-1细胞。

1.4.1 荧光定量PCR（qPCR）检测HLF-1 中NNMT 的mRNA表达 取稳定转染后的过表达NNMT 组和control 组HLF-1细胞，TRIzol 法提取RNA 并用凝胶电泳对其质量进行评估。使用Power SYBR Green 进行qPCR，以GAPDH 为内参。NNMT 上游引物5'-AGGAACCAGGAGCCTTTGACT-3'，下游引物5'-CCTGAGGGCAGTGCGATAGG-3'；GAPDH 上游引物5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3' ，下 游 引 物 5'-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3'。按照PCR 检测试剂盒说明书进行实验，扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，40 个循环。结果采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.4.2 细胞免疫荧光染色检测HLF-1 细胞中NNMT 蛋白表达水平 将2组细胞接种至细胞爬片，24 h后取出细胞爬片，4%多聚甲醛室温固定15 min，0.2%Triton X-100室温破膜10 min，封闭液室温封闭1 h，一抗（1∶100 稀释）4 ℃过夜，二抗Alexa fluo594（1∶200）室温下反应1 h，DAPI核染色，封片。在激光共聚焦显微镜观察、拍照。

1.4.3 Western blot 检测HLF-1 细胞中NNMT 蛋白表达水平 取对数生长期的2 组细胞（约2×106个），RIPA 裂解液提取蛋白，BCA 法测量蛋白浓度后上样（50 μg），10% SDSPAGE 90 min，250 mA转膜2 h湿转法将蛋白转移于PVDF膜上，切取含目的条带的PVDF膜用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。NNMT（1∶2 000）与β-actin（1∶5 000）一抗4 ℃孵育过夜，次日羊抗兔二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，洗膜后ECL显影。采用Image J软件对蛋白条带进行灰度值分析，以目的蛋白条带灰度值与内参照蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.5 细胞共培养 NNMT组及control组HLF-1细胞常规培养24 h后收集培养液至50 mL离心管，1 000 r/min离心5 min，吸取上清作为培养基加入A549和PC9细胞中进行共培养。

1.5.1 CCK-8法检测细胞增殖能力 取共培养后的A549和PC9 细胞，接种于96 孔板中（2.5×104/mL），各组设3 个复孔，然后分别在培养24、48、72、96及120 h弃去原有培养液，加入含10%CCK-8 的培养液100 μL，孵育2 h 后用酶标仪测各孔490 nm处的光密度（OD）值，并绘制生长曲线。

1.5.2 平板克隆形成实验 取共培养后的A549 和PC9 细胞，1 000 个/孔接种于6 孔板中，静置培养10～14 d，当出现肉眼可见的克隆时，弃去上清液，加入甲醇于-20 ℃冰箱中固定克隆6 min，0.1%结晶紫溶液室温染色30 min。在光学显微镜（400倍）下计数＞50个细胞的克隆数。

1.5.3 Transwell 实验检测细胞侵袭能力 取对数生长期A549和PC9细胞，制备单细胞悬液，离心后用不含血清的培养液重悬细胞计数，在小室的上室中加入约10 000 个细胞，在24孔板中加入500 μL稳定表达NNMT的肺成纤维细胞系及control 组细胞24 h的培养液，将小室放在24孔板中；培养24 h 后，棉签擦拭上室中未穿过小室膜的细胞，结晶紫染色后在显微镜下采集图像，40 倍光学显微镜下随机读取10 个视野，记录穿膜细胞数并进行统计分析。

1.5.4 划痕愈合实验检测细胞迁移能力 取对数生长期A549 和PC9 细胞，5×105个/孔接种于6 孔板中。24 h 后用20 μL移液器枪头在细胞表面划痕，PBS清洗脱落细胞，加入稳定表达NNMT 的肺成纤维细胞系及control 组细胞24 h 的培养液，于24 h 在光学显微镜下测量划痕宽度并拍照，计算细胞迁移率，迁移率（%）=（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.6 统计学方法 应用SPSS 16.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料以例表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier 法绘制不同NNMT 表达情况肺腺癌患者的生存曲线，Log-rank 检验比较生存率的差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

Fig.1 NNMT expression in lung adenocarcinoma(DAB staining,×400)图1 NNMT在肺腺癌组织中的表达（DAB显色，×400）

Fig.2 The survival curves of patients with high and low NNMT expressions in lung adenocarcinoma图2 肺腺癌中NNMT高表达和低表达患者的生存曲线

2.1 NNMT在肺癌组织中的表达及其与患者预后及临床病理特征关系 免疫组化染色结果显示，NNMT 在肺腺癌癌细胞和间质细胞中均有表达，且主要定位在细胞质，见图1。经半定量分析后，150例患者中65例癌细胞中NNMT高表达，83例间质细胞中NNMT高表达。生存分析结果见图2，癌细胞中高表达与低表达NNMT患者的总生存率差异无统计学意义（Log-rankχ2=2.625，P＞0.05），而肿瘤间质细胞中高表达NNMT患者的总生存率明显低于低表达者（Log-rankχ2=9.685，P＜0.01），预后较差。有淋巴结转移和病理分期Ⅲ～Ⅳ期患者肿瘤间质细胞中NNMT高表达比例较高；同时病理分期Ⅲ～Ⅳ期患者肿瘤细胞中NNMT 高表达比例较高，其他不同临床病理特征间差异无统计学意义，见表1。

Tab.1 Comparison of the expression levels of NNMT in tumor stromal cells and tumor cells of lung adenocarcinoma between patients with different clinicopathological features表1 不同临床病理特征的肺腺癌患者的肿瘤间质及肿瘤细胞NNMT表达水平比较 例（%）

2.2 成功构建稳定过表达NNMT 的HFL-1 细胞 Western blot（图3A）、qPCR（图3B）、细胞免疫荧光染色（图3C）结果均显示，NNMT 组NNMT 的表达水平均高于control组。

2.3 肺成纤维细胞中过表达NNMT 对肺癌细胞迁移的影响 划痕愈合实验和Transwell 实验结果显示，与control组相比，NNMT组的HFL-1的培养液均可促进A549 和PC9 细胞的迁移和侵袭。见表2、图4。

Fig.3 Identification of stable NNMT expression in HFL-1 cells图3 HFL-1细胞中稳定表达NNMT的鉴定结果

Tab.2 Comparison of cell mobility and invasion number between control group and NNMT group表2 Control组和NNMT组细胞迁移率和侵袭数量比较（n=3，x±s）

2.4 HFL-1 的培养液对A549 和PC9 增殖及克隆的影响 HFL-1 培养液与肺癌细胞共培养后发现，与control 组相比，NNMT 组A549 和PC9 细胞增殖速度自2 d 起均显著加快（图5A），细胞克隆的形成能力明显提高［A549 细胞：（93.00±13.45）个/视野vs.（56.67±4.16）个/视野，t=4.469，P＜0.01；PC9 细胞：（160.70±11.02）个/视野vs.（91.67±9.67）个/视野，t=7.465，P＜0.01］，见图5B。

Fig.4 Changes of lung cancer cell migration and invasion ability in control group and NNMT group图4 对照组和NNMT组肺癌细胞迁移和侵袭能力变化

Fig.5 Changes of proliferation and clone formation of lung cancer cells in control group and NNMT group图5 对照组和NNMT组肺癌细胞增殖及克隆形成数量变化

3 讨论

近年来，肺癌的手术治疗、辅助化疗以及靶向治疗均取得了较大的进展，但肺癌5 年生存率依然很低。因此，寻求新的治疗靶点及预后指标能够为肺癌治疗提供新思路。在本研究中，笔者发现肺腺癌间质细胞中高表达NNMT 提示患者不良预后，而且CAF的条件培养基可以促进肺癌细胞的恶性进展。

NNMT 是N-甲基转移酶家族的一种胞质酶，可以通过消耗甲基供体和产生活性代谢物参与调节脂肪、肝脏等组织代谢；NNMT的活性升高可有效降低细胞内的烟酰胺水平，进而抑制细胞凋亡［9］。研究发现NNMT 在多种癌细胞中呈高表达，而且NNMT的上调参与了多种恶性肿瘤细胞的增殖和迁移，NNMT 可能是一种潜在的肿瘤标志物［10-11］。Tomida等［12］发现肺癌患者血清中NNMT水平显著高于健康人群，且比常用的血清指标癌胚抗原（CEA）更加敏感。另有研究发现NNMT在肺癌组织中的表达水平高于癌旁组织，在肺癌细胞中敲减NNMT后，细胞的增殖和克隆形成能力均受到抑制［13］。另外，NNMT在非小细胞肺癌对靶向药物耐药过程中也起着重要的作用［14］。然而，关于NNMT 促进肺癌发生发展的确切分子机制仍不清楚。

肿瘤微环境在肿瘤生长和转移过程中起着重要的作用，CAF 作为肿瘤微环境中最主要的细胞成分之一，可以促进肿瘤的发生发展［15-16］。研究发现，敲减CAF 细胞中的NNMT 后，细胞内与转录调控相关的组蛋白的甲基化修饰显著增加，进而调控多种基因的表达，其中包括多种癌基因［8］。但目前尚不清楚NNMT在肺癌间质中是否发挥着相似的促进肿瘤恶性进展的功能。本研究在人成纤维细胞系HFL-1中过表达NNMT，然后收集过表达NNMT 细胞和control 组细胞的培养液，用以上2 种培养液培养肺腺癌细胞A549 和PC9，比较2 组培养液对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果发现，来源于过表达NNMT组的培养液可以显著促进肺癌细胞的增殖和克隆的形成，而且对肺癌细胞的迁移和侵袭能力也有显著的促进作用，提示CAF 的条件培养基可以促进肺腺癌细胞的恶性转化。NNMT作为一种活跃的代谢酶，是通过影响间质细胞的代谢进而影响肿瘤细胞，还是通过外泌体等途径将间质细胞的NNMT 直接转移到肿瘤细胞中，其中涉及的具体机制尚需进一步的实验证实。同时本研究免疫组化结果显示，NNMT 在肺腺癌的癌细胞和间质细胞中均有表达。其中，肿瘤间质中NNMT 的蛋白表达水平与淋巴结转移、临床分期有关，而且肿瘤间质中的高表达NNMT 的患者总生存率明显下降，提示肺癌间质中的NNMT可促进肿瘤细胞的恶性进展。

综上，肺腺癌间质中的NNMT 在肺癌恶性转化过程中起着重要的促进作用，有可能成为肿瘤靶向生物治疗的潜在靶点。