硒酵母联合维生素D对实验性自身免疫甲状腺炎大鼠甲状腺相关激素及抗体的影响

侯丽萍，耿建林，谷巍，刘晴晴

自身免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）是临床常见的器官特异性自身免疫性疾病，表现为甲状腺肿大、咽部不适、颈部压痛、吞咽困难等症状，给患者工作和生活造成一定的影响［1］。实验性自身免疫性甲状腺炎（experimental autoimmune thyroidits，EAT）动物模型与人类AIT 具有相同的病理基础与临床表现，是研究AIT 的重要工具［2］。硒是人体所必需的微量元素，硒缺乏可致机体免疫功能下降，补硒可降低AIT患者甲状腺抗体水平，调节T细胞亚群平衡［3］。维生素D具有免疫调节作用，维生素D缺乏是多种自身免疫性疾病的重要影响因素之一［4］。硒和维生素D有利于改善AIT，两者联合应用可以提高机体自身免疫力。既往研究表明，丝裂原活化蛋白激酶（motigen-activated protein kinase，MAPK）通路广泛参与细胞凋亡、增殖和分化等活动过程，与多种免疫性疾病有关［5］。本研究通过建立EAT 大鼠模型，评估硒酵母联合维生素D 对EAT 相关激素和抗体的作用，探讨其改善EAT的作用机制，为临床治疗AIT提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 55 只SPF 级雌性SD 大鼠，5 周龄，体质量（130±10）g，购自上海杰思捷实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（沪）2018-0004。饲养于SPF 级环境，温度20～25 ℃、相对湿度45%～65%，光照12 h/黑暗12 h循环。实验前适应性饲养3 d。

1.1.2 药物、主要试剂和仪器 硒酵母片［国药准字H10940161，50 μg（以每片70 mg硒酵母中含硒量计）］购自牡丹江灵泰药业有限公司，维生素D3注射液（国药准字H31021404，1 mL∶7.5 mg）购自上海通用药业股份有限公司，猪甲状腺球蛋白（pTG）、磷酸缓冲盐溶液（PBS），完全弗氏佐剂（CFA）、不完全弗氏佐剂（IFA）均购自美国Sigma 公司，大鼠游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，促甲状腺激素（TSH）、甲状腺球蛋白抗体（TGAb）、甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）ELISA试剂盒均购自武汉基因美生物科技有限公司，大鼠干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-4 ELISA试剂盒均购自美国R&D公司，反转录试剂盒购自日本TOYOBO 公司，PCR 试剂盒购自美国KAPA Biosystems 公司，兔抗大鼠p38MAPK、p-p38MAPK、环氧合酶-2（COX-2）单抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 均购自美国Cell Signaling Technology 公司，ELX8000酶标仪、电泳仪购自美国Bio-rad公司，PCR仪购自瑞士Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 EAT 大鼠模型建立及分组 将10 mg pTG 溶解于5 mL PBS 中，再与5 mL CFA 混合，充分乳化，制成抗原含量为1 g/L的pTG乳化剂备用；称体质量后采用随机数字表法抽取45 只大鼠参与建模，pTG 乳化剂按1 mL/kg 体质量于大鼠足垫及背部皮下多点注射，每周1 次，连续2 周，为初次免疫。2 周后采用同法加强免疫：取pTG 与IFA 混合充分乳化制成乳化剂备用，pTG 乳化剂按1 mL/kg 体质量于大鼠皮下多点注射，每周1 次，连续4 周。大鼠造模期间避光，不限量饮用0.05%碘化钾水。加强免疫2 周后，建模大鼠眶静脉取血1 mL/只，检测血清TPOAb 水平，TPOAb 滴度≥60 IU/mL 为建模成功［6］。其余10 只大鼠为对照组，前2 周按1 mL/kg 体质量皮下多点注射CFA 和PBS等体积混合的乳化剂，后4周按1 mL/kg 体质量皮下多点注射IFA 和PBS 等体积混合的乳化剂。建模成功大鼠（40只）采用随机数字表法分为模型组、硒酵母组、维生素D组和硒酵母组+维生素D联合组（联合组），每组10只。

1.2.2 给药方法 加强免疫4周后进行药物干预，将40片硒酵母片碾碎溶于100 mL生理盐水，配制成20 g/L硒酵母溶液备用。对照组和模型组：生理盐水灌胃（10 mL/kg，1次/d）+腹腔注射生理盐水（0.67 mL/kg，隔天1次）。硒酵母组：硒酵母溶液灌胃（10 mL/kg，1次/d）+腹腔注射生理盐水（0.67 mL/kg，隔天1次）；维生素D组：生理盐水灌胃（10 mL/kg，1次/d）+腹腔注射维生素D3注射液（0.67 mL/kg，隔天1 次）；联合组：硒酵母溶液灌胃（10 mL/kg，1次/d）+腹腔注射维生素D3注射液（0.67 mL/kg，隔天1次）。各组均连续给药6周。

1.2.3 血清FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb、IFN-γ、IL-4 检测 末次干预后禁食12 h，腹主动脉采血5 mL 置于离心管中静置1 h，3 000 r/min 离心10 min（离心半径12 cm）取上清，-20 ℃保存。取保存血清，按照ELISA试剂盒说明书测定血清FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb、IFN-γ、IL-4，用酶标仪在450 nm 波长测量各样品孔吸光度值，绘制标准曲线，计算待测样品各指标浓度。

1.2.4 甲状腺病理学形态观察 采血完毕处死大鼠并置于载物台上，充分暴露颈部，分离双侧甲状腺组织，左侧甲状腺置于10%中性福尔马林固定72 h，右侧甲状腺置于液氮中保存备用。取固定甲状腺组织约1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm，脱水浸蜡包埋，切成5 μm薄片，脱蜡，常规苏木精-伊红染色法（HE）染色，中性树胶封固后置于光镜下观察。

1.2.5 甲状腺组织中p38MAPK、COX-2 mRNA相对表达量检测 取液氮保存的甲状腺组织80 mg，研磨后Trizol法提取总RNA，测定RNA 纯度及浓度，取适量RNA 为模板，按照反转录试剂盒说明书反转录cDNA，进行实时荧光定量PCR（qPCR）扩增。反应体系：上、下游引物各1 μL，2 μL 模板cDNA，10 μL SYBR Premix ExTaq Ⅱ（2×），加双蒸水至总体积20 μL。反应条件：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，35个循环。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，每个样本做3次，取Ct平均值。引物序列见表1。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.6 甲状腺组织中p38MAPK、p-p38MAPK、COX-2蛋白相对表达量检测 取液氮保存甲状腺组织80 mg，加入裂解液冰上孵育30 min，提取组织总蛋白，BAC法测定蛋白浓度，稀释蛋白样品，蛋白变性，上样。100 V电泳2 h，转至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶摇床封闭2 h，加入稀释的一抗p38MAPK（1∶1 000）、p-p38MAPK（1∶1 000）、COX-2（1∶1 000）和βactin（1∶1 000）4 ℃摇床过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000），室温摇床封闭2 h，加ECL试剂反应后压片、显影、定影，采用Image J软件分析灰度值，与β-actin内参灰度做比值进行分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料均以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb 水平比较 与对照组相比，模型组、硒酵母组、维生素D组和联合组FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb水平均升高（P＜0.05）；与模型组比较，硒酵母组、维生素D组、联合组FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb水平均降低（P＜0.05）；与硒酵母组、维生素D组比较，联合组FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb水平均降低（P＜0.05）；硒酵母组与维生素D组FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

Tab.2 Comparison of serum levels of FT3,FT4,TSH,TGAb and TPOAb between five groups of rats表2 5组大鼠血清FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb水平比较 （n=10，±s）

Tab.2 Comparison of serum levels of FT3,FT4,TSH,TGAb and TPOAb between five groups of rats表2 5组大鼠血清FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb水平比较 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与硒酵母组比较，d与维生素D组比较，P＜0.05

组别对照组模型组硒酵母组维生素D组联合组F FT3（pmol/L）4.96±5.54 37.16±4.13a 28.84±3.21ab 26.97±2.95ab 20.17±2.47abcd 99.837＊＊FT4（pmol/L）25.81±3.78 147.67±15.25a 87.69±9.12ab 90.17±9.85ab 65.49±6.86abcd 206.500＊＊组别对照组模型组硒酵母组维生素D组联合组F TSH（ng/L）2 061.04±236.14 4 150.82±425.58a 3 216.26±341.65ab 3 345.57±355.24ab 2 645.57±275.23abcd 55.235＊＊TGAb（ng/L）24.12±2.67 176.36±18.58a 74.97±8.12ab 87.23±9.64ab 46.45±5.68abcd 312.731＊＊TPOAb（ng/L）21.57±2.51 152.38±16.16a 84.82±8.65ab 91.63±9.26ab 54.72±6.19abcd 253.381＊＊

2.2 各组甲状腺病理组织学形态 HE染色结果显示，对照组可见甲状腺滤泡排列规则紧密，胶质丰富分布均匀，滤泡间无淋巴细胞浸润，无纤维化。模型组甲状腺滤泡结构严重破坏，形态不规则，部分滤泡萎缩，胶质稀少且分布不均，滤泡间可见大量淋巴细胞浸润，周围可见纤维组织增生。硒酵母组和维生素D组滤泡形态较完整，可见部分滤泡结构破坏，胶质减少，滤泡间可见淋巴细胞浸润，与模型组比有一定改善。联合组滤泡形态大部分较规则，胶质较多，滤泡间可见少量淋巴细胞浸润，滤泡破坏及淋巴细胞浸润较模型组有显著改善。见图1。

Fig.1 Comparison of histopathological changes of thyroid gland between five groups of rats(HE，×200)图1 5组大鼠状腺组织病理学变化比较（HE，×200）

2.3 各组大鼠血清IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平比较 与对照组比较，模型组、硒酵母组、维生素D组、联合组IFN-γ、IFN-γ/IL-4水平均升高，IL-4水平均降低（P＜0.05）；与模型组比较，硒酵母组、维生素D组、联合组IFN-γ、IFN-γ/IL-4 水平均降低，IL-4 水平均升高（P＜0.05）；与硒酵母组、维生素D组比较，联合组IFN-γ、IFN-γ/IL-4水平均降低，IL-4水平升高（P＜0.05）；硒酵母组与维生素D 组IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

Tab.3 Comparison of serum levels of IFN-γ,IL-4 and IFN-γ/IL-4 between five groups of rats表3 5组大鼠血清IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平比较（n=10，±s）

Tab.3 Comparison of serum levels of IFN-γ,IL-4 and IFN-γ/IL-4 between five groups of rats表3 5组大鼠血清IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平比较（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与硒酵母组比较，d与维生素D组比较，P＜0.05

组别对照组模型组硒酵母组维生素D组联合组F IFN-γ（ng/L）135.86±18.47 376.31±38.13a 226.97±25.17ab 235.81±25.49ab 176.89±18.05abcd 121.661＊＊IL-4（ng/L）141.48±15.14 72.53±8.16a 104.91±12.06ab 110.05±12.72ab 123.61±13.74abcd 41.120＊＊IFN-γ/IL-4 0.96±0.11 5.19±0.52a 2.16±0.25ab 2.14±0.23ab 1.43±0.17abcd 319.849＊＊

2.4 各组大鼠甲状腺组织中p38MAPK、COX-2 mRNA 水平比较 与对照组比较，模型组、硒酵母组、维生素D组、联合组COX-2 mRNA相对表达量均升高（P＜0.05）；与模型组比较，硒酵母组、维生素D组、联合组COX-2 mRNA 相对表达量均降低（P＜0.05）；与硒酵母组、维生素D组比较，联合组COX-2 mRNA 相 对 表 达 量 均 降 低（P＜0.05）。 各 组p38MAPK mRNA 相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

Tab.4 Comparison of p38MAPK and COX-2 mRNA levels in thyroid tissues between five groups of rats表4 5组大鼠甲状腺组织中p38MAPK、COX-2 mRNA水平比较 （n=10，±s）

Tab.4 Comparison of p38MAPK and COX-2 mRNA levels in thyroid tissues between five groups of rats表4 5组大鼠甲状腺组织中p38MAPK、COX-2 mRNA水平比较 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与硒酵母组比较，d与维生素D组比较，P＜0.05

组别对照组模型组硒酵母组维生素D组联合组F p38MAPK 1.00±0.00 1.08±0.12 1.03±0.11 1.05±0.12 1.07±0.11 0.972 COX-2 1.00±0.00 1.96±0.15a 1.57±0.13ab 1.65±0.15ab 1.28±0.12abcd 3.067＊＊

2.5 各组大鼠甲状腺组织中p38MAPK、pp38MAPK、COX-2 蛋白水平比较 与对照组比较，模型组、硒酵母组、维生素D 组、联合组pp38MAPK、COX-2 蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）；与模型组比较，硒酵母组、维生素D 组、联合组p-p38MAPK、COX-2蛋白相对表达量均降低（P＜0.05）；与硒酵母组、维生素D 组比较，联合组pp38MAPK、COX-2 蛋白相对表达量均降低（P＜0.05）；硒酵母组与维生素D 组p-p38MAPK、COX-2蛋白相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组p38MAPK 蛋白相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5、图2。

Tab.5 Comparison of p38MAPK,p-p38MAPK and COX-2 protein levels in thyroid tissues between five groups of rats表5 5组大鼠甲状腺组织中p38MAPK、p-p38MAPK、COX-2蛋白水平比较 （n=10，±s）

Tab.5 Comparison of p38MAPK,p-p38MAPK and COX-2 protein levels in thyroid tissues between five groups of rats表5 5组大鼠甲状腺组织中p38MAPK、p-p38MAPK、COX-2蛋白水平比较 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与硒酵母组比较，d与维生素D组比较，P＜0.05

组别对照组模型组硒酵母组维生素D组联合组F p38MAPK 1.06±0.11 1.05±0.12 1.07±0.10 1.10±0.11 1.09±0.10 0.367 p-p38MAPK 0.15±0.02 0.98±0.13a 0.73±0.08ab 0.76±0.07ab 0.28±0.04abcd 202.732＊＊COX-2 0.21±0.02 0.95±0.10a 0.63±0.07ab 0.67±0.08ab 0.32±0.05abcd 180.331＊＊

Fig.2 Comparison of p38MAPK,p-p38MAPK and COX-2 protein levels in thyroid tissues between five groups of rats图2 5组大鼠甲状腺组织中p38MAPK、p-p38MAPK、COX-2蛋白水平比较

3 讨论

甲状腺是人体最大的内分泌器官，由滤泡上皮细胞组成，其主要功能是合成甲状腺激素，调节机体平衡。AIT 是器官特异性自身免疫性疾病，由于机体异常识别自身抗原，引起淋巴细胞侵入并攻击甲状腺组织，从而导致甲状腺功能受损。目前临床治疗AIT 多为甲状腺激素的替代治疗，但激素替代疗法无法阻止甲状腺的破坏，且易合并其他自身免疫性疾病［7］。因此，寻找新的治疗方法对早期干预AIT有重要意义。硒在甲状腺组织中具有重要作用，通过补硒治疗，可有效缓解AIT病情［8］。维生素D及其代谢产物对于自身免疫类疾病有良好的调节作用，可以阻止AIT 病理发展［9］。故本研究选取常用的补硒制剂硒酵母片及维生素D3注射液，观察其对EAT的缓解作用，探讨其作用机制。

FT3、FT4、TSH 主要反映甲状腺功能是否异常，TGAb、TPOAb 则是甲状腺自身抗体，在AIT 发病过程中有重要作用，是反映甲状腺自身免疫病的特异性指标。本研究中模型组大鼠表现出典型EAT 症状，经治疗后，HE染色显示硒酵母组、维生素D组及联合组甲状腺组织病理形态都较模型组有显著改善，其中联合组改善效果最明显；同时与模型组比较，硒酵母组、维生素D 组及联合组血清FT3、FT4、TGAb、TPOAb 水平显著下降，其中以联合组下降最明显，提示硒酵母和维生素D 能有效抑制EAT 的进展。Pirola 等［10］发现补硒治疗可显著降低AIT 患者患者TPOAb 水平，有效缓解病情。Krysiak 等［11-12］发现AIT 患者服用维生素D 后，TPOAb 滴度、TSH、TGAb 水平较未服用者显著降低。本研究与上述研究结果相一致，表明硒和维生素D 均可有效改善EAT大鼠症状，减轻甲状腺组织损伤，保护甲状腺功能，且两者联合应用效果更好。

AIT 发生与Th1/Th2 细胞失衡存在密切关系，AIT 发展过程中以Th1 细胞因子优势表达，其中IFN-γ 是Th1 细胞的特征分子，本研究中模型组大鼠IFN-γ/IL-4 明显升高，提示处于Th1/Th2 细胞失衡状态，与既往研究结果相符［13-14］。MAPK 信号通路在炎症反应过程中起重要作用，p38MAPK是其重要成员，当细胞受到各种因素刺激时可以磷酸化形成p-p38MAPK，p-p38MAPK 引起核转录因子κB 活化，进而促进白细胞介素等炎症因子表达，p38MAPK 作为上游调节因子，调节下游COX-2 表达，COX-2 表达增加刺激炎症因子产生，介导全身炎症反应［15］。本研究发现，经治疗后，硒酵母组、维生素D 组及联合组IFN-γ/IL-4 显著下降，COX-2 mRNA 及蛋白、p-p38MAPK 蛋白表达显著下降，提示硒酵母和维生素D可显著调节Th1/Th2细胞失衡，可能是通过下调p38MAPK 及COX-2 表达从而抑制MAPK信号通路发挥调节作用。

综上所述，硒酵母联合维生素D 可有效改善EAT大鼠症状，减轻甲状腺组织损伤，保护甲状腺功能，其机制可能是通过抑制MAPK 信号通路调节Th1/Th2平衡来发挥调控作用。