基于EphrinBs/EphBs通路探讨桃红四物汤治疗带状疱疹后遗神经痛大鼠模型的作用机制

徐俊涛，王丽△，王莹，马飞，方玉甫

带状疱疹是一种常见的由水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）所引起的急性皮肤病，而带状疱疹后遗神经痛（postherpetic neuralgia，PHN）是带状疱疹最常见的并发症之一，其中痛觉过敏、自发痛和诱发痛是其主要症状，给患者身心健康和生活质量造成了极大困扰［1-2］。桃红四物汤是活血养血的经典方，具有调经镇痛、抗炎、提高免疫力和促进骨折愈合等作用［3］。近年有报道指出桃红四物汤在治疗PHN方面疗效满意［4-5］，但其具体作用机制尚不明确。EphBs 是酪氨酸激酶亚家族成员，可与其配体EphrinBs结合组成EphrinBs/EphBs信号通路，在轴突导向、突触可塑性、血管再生和组织边缘形成等方面发挥着重要作用，与神经病理性疼痛密切相关［6］。EphrinBs/EphBs 信号通路是否参与桃红四物汤改善PHN 的分子机制并不清楚。本研究基于EphrinBs/EphBs通路，探讨桃红四物汤对PHN模型大鼠的治疗效果及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只SPF级健康雄性SD大鼠，6周龄，体质量160～200 g，购自广西医科大学动物科学实验中心，合格证号：SYXK 桂2014-003。大鼠在湿度为（50±10）%、温度为（24±2）℃和光照周期为10 h的环境下自由进食和饮水，饲养期间无噪音和强光刺激。本研究动物实验已通过河南省中医院伦理委员会批准，实验操作过程均符合实验动物的伦理条例。

1.2 药品、试剂与仪器 桃红四物汤组分：熟地黄、白芍、当归、川芎和桃仁各9 g，红花6 g均购自河南省中医院大药房，以10 倍量的75%乙醇回流提取2 h，再以8 倍量的75%乙醇回流提取2 h，将2 次提取液合并浓缩成生药浓度为1 g/mL。普瑞巴林胶囊（国药准字H20130073）购自重庆赛维药业有限公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，原位末端转移酶标记技术（TUNEL）试剂盒购自瑞士Roche 公司，肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒和全蛋白提取试剂盒购于北京索莱宝生物公司，二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度检测试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，EphrinB2-Fc 和EphB2-Fc 购自美国Sigma 公司，EphrinB2、EphB2 和β-actin 抗体购自美国Santa Cruz 公司，放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液购自上海信帆生物科技有限公司，凝胶成像分析系统（型号：SYSTEM GelDoc XR+）购自美国Bio-Rad公司，电子测痛仪（型号：Von Frey）购自上海玉研科学仪器有限公司。

1.3 PHN模型构建 采用随机数字表法取10只大鼠作为空白组，剩余50 只大鼠应用VZV 慢性感染法［7］构建PHN 大鼠模型。具体步骤如下：采用DMEM/F12 完全培养基将CV-1细胞（美国ATCC）制成细胞悬液，按照5×104个/cm2细胞密度接种至培养瓶中；以VZV 感染CV-1 细胞，感染2 d 至约80%细胞被感染时，以磷酸缓冲液将被感染细胞制成细胞悬液；将含VZV 的细胞悬液50 μL 以1.2×108/mL 接种至SD 大鼠左趾蹼中，空白组大鼠左趾蹼注射等量生理盐水；待接种3～4 d后大鼠出现机械痛阈值异常时证明PHN大鼠模型构建成功。

1.4 实验分组与给药处理 50只PHN模型大鼠采用随机数字表法分为5 组（n=10）：（1）模型组。造模第3 天以15 mg/（kg·d）生理盐水灌胃。（2）阳性组。造模第3 天以普瑞巴林27 mg/（kg·d）灌胃。（3）治疗组。造模第3天以桃红四物汤5 g/（kg·d）灌胃。（4）治疗+EphB2-Fc 组。造模第3 天鞘内注射EphB2-Fc 5 μg 后，以桃红四物汤5 g/（kg·d）灌胃。（5）治疗+EphrinB2-Fc 组。造模第3天鞘内注射EphrinB2-Fc 5 μg后，以桃红四物汤5 g/（kg·d）灌胃。另空白组以15 mg/（kg·d）生理盐水灌胃，各组按照剂量连续给药14 d。

1.5 行为学实验测定大鼠机械痛阈值 采用电子测痛仪分别在给药后1 d、7 d和14 d时对各组大鼠进行机械痛阈值测定。将大鼠置于底部为金属网的透明玻璃箱内适应30 min并处于平静状态后，开始测试。将仪器探头尖端垂直轻柔地刺激大鼠后足底部，逐渐增加刺激力度，当大鼠出现缩足、舔足和弹退等行为时，记录电子测痛仪显示的最大值。其中，每间隔5 min检测1次，连续检测3次。

1.6 ELISA 法检测脊髓组织中IL-1β 和TNF-α 水平 在机械痛阈值检测结束后，将大鼠断头处死，取L4～L6脊髓组织，分为四部分：第一部分置于液氮中冻存30 min 后放入-80 ℃冰箱中保存，用于蛋白免疫印迹（Western blot）实验；第二部分以4% 多聚甲醛固定；第三部分用于检测脊髓组织Caspase-3 活性；第四部分加入9 倍的生理盐水制成匀浆，1 000 r/min 离心10 min 后，参照ELISA 试剂盒说明书检测大鼠脊髓组织中IL-1β和TNF-α水平。

1.7 TUNEL 法检测脊髓神经细胞凋亡 取4%多聚甲醛固定后的脊髓组织，行5 μm 厚常规石蜡切片。经脱蜡和水化后，加入20 g/L蛋白酶K在37 ℃下消化30 min。以磷酸缓冲液洗涤5 min，重复3 次后，在37 ℃下以20 μL 小牛血清封闭15 min，再加入20 μL TUNEL 反应液37 ℃孵育1 h。经磷酸缓冲液洗涤后，以0.3%H2O2孵育10 min；以磷酸缓冲液洗涤后，采用正常羊血清在37 ℃下封闭15 min，然后在37 ℃下以辣根过氧化物酶孵育30 min。经磷酸缓冲液洗涤后，二氨基联苯胺显色，并以自来水冲洗使反应终止，再以磷酸缓冲液洗涤。经脱水、透明和封片后，采用高倍显微镜随机读取5个视野计数，细胞凋亡指数=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。

1.8 荧光分光光度计法检测脊髓组织Caspase-3活性 取各组大鼠L4～L6 脊髓组织，参照Caspase-3 活性检测试剂盒说明书，采用荧光分光光度计在535 nm 发射波长与485 nm 激发波长处检测荧光强度，结果以实验组与对照组荧光强度的比值表示Caspase-3活性。

1.9 Western blot 检测脊髓组织中EphrinB2和EphB2的蛋白相对表达量 取L4～L6 脊髓组织，加入RIPA 裂解液制成匀浆，按照总蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白后，采用BCA法检测总蛋白浓度与纯度。将符合要求的蛋白样品与上样缓冲液等体积混合后，置于沸水浴中煮沸5 min。将变性后的蛋白样品按照每孔60 μg 上样至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上行电泳分离。待电泳结束后，转至聚偏氟乙烯膜上。经5%脱脂奶粉封膜2 h后，加入EphrinB2抗体（1∶100）、EphB2抗体（1∶100）和β-actin抗体（1∶1 000）4 ℃下孵育24 h。经磷酸缓冲液洗膜5 min×3 次后，加入辣根过氧化酶标记的二抗（1∶2 000）37 ℃孵育2 h。磷酸缓冲液洗膜后，加入化学发光剂暗室内显影曝光。采用凝胶成像分析系统扫描分析目的条带灰度值，以目的条带灰度值与内参β-actin 条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.10 统计学方法 采用SPSS 24.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，2 组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验；不同时点多组间比较采用重复测量设计的方差分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组PHN 大鼠机械痛阈值的比较 与空白组比较，PHN 模型大鼠在给药后相同时间下机械痛阈值明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，给予桃红四物汤治疗的大鼠在给药后1 d 时机械痛阈值差异无统计学意义（P＞0.05），但在给药后7 d 和14 d 时机械痛阈值均明显升高（P＜0.05）。给药后7 d和14 d时与治疗组相比，给予EphBs阻滞剂EphB2-Fc后大鼠机械痛阈值明显升高，而给予EphBs 激动剂EphrinB2-Fc 后大鼠机械痛阈值明显降低（P＜0.05），见表1。

2.2 各组PHN 大鼠脊髓组织中炎性因子IL-1β 和TNF-α 水平的比较 与空白组比较，PHN 模型大鼠脊髓组织中IL-1β 和TNF-α 水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，给予桃红四物汤治疗后大鼠脊髓组织中IL-1β 和TNF-α 水平均明显降低（P＜0.05）；与治疗组比较，给予EphBs 阻滞剂EphB2-Fc后大鼠脊髓组织中IL-1β 和TNF-α 水平均明显降低，而给予EphBs 激动剂EphrinB2-Fc 后IL-1β 和TNF-α水平均明显升高（P＜0.05），见表2。

Tab.1 Comparison of mechanical pain thresholds between six groups of rats表1 6组大鼠机械痛阈值比较 （n=10，g，x±s）

Tab.2 Comparison of the levels of IL-1β and TNF-α in spinal cord tissues between six groups表2 6组大鼠脊髓组织中IL-1β和TNF-α水平比较（n=10，ng/L，±s）

Tab.2 Comparison of the levels of IL-1β and TNF-α in spinal cord tissues between six groups表2 6组大鼠脊髓组织中IL-1β和TNF-α水平比较（n=10，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a与空白组比较，b与模型组比较，c与阳性组比较，d与治疗组比较，e与治疗+EphB2-Fc组比较，P＜0.05

组别空白组模型组阳性组治疗组治疗+EphB2-Fc组治疗+EphrinB2-Fc组F IL-1β 3.29±0.20 9.62±1.52a 4.96±1.15ab 6.83±1.23abc 4.08±1.02bd 9.52±1.15acde 59.476＊＊TNF-α 10.54±1.38 26.73±3.25a 13.36±2.19ab 18.65±2.03abc 13.12±1.10bd 23.26±2.12abcde 90.542＊＊

2.3 各组PHN 大鼠脊髓神经细胞凋亡的比较 与空白组比较，PHN 模型大鼠脊髓神经细胞凋亡指数和Caspase-3 活性均明显升高（P＜0.05）；给予桃红四物汤处理后大鼠脊髓神经细胞凋亡指数和Caspase-3 活性较模型组均明显降低（P＜0.05）；与治疗组比较，给予EphBs阻滞剂EphB2-Fc后大鼠脊髓神经细胞凋亡指数和Caspase-3活性均明显降低，而给予EphBs 激动剂EphrinB2-Fc 后大鼠脊髓神经细胞凋亡指数和Caspase-3 活性均明显升高（P＜0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of apoptosis index and Caspase-3 activity of spinal neurons between six groups表3 6组大鼠脊髓神经细胞凋亡指数和Caspase-3活性比较 （n=10，±s）

Tab.3 Comparison of apoptosis index and Caspase-3 activity of spinal neurons between six groups表3 6组大鼠脊髓神经细胞凋亡指数和Caspase-3活性比较 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与空白组比较，b与模型组比较，c与阳性组比较，d与治疗组比较，e与治疗+EphB2-Fc组比较，P＜0.05

组别空白组模型组阳性组治疗组治疗+EphB2-Fc组治疗+EphrinB2-Fc组F凋亡指数（%）2.30±0.10 15.06±2.13a 6.82±1.36ab 9.17±2.51ab 5.54±2.02abd 12.68±2.16acde 62.077＊＊Caspase-3活性1.00±0.00 3.28±0.23a 1.56±0.18ab 2.02±0.12abc 1.25±0.12abcd 2.87±0.10abcde 401.457＊＊

2.4 各组PHN 大鼠脊髓组织中EphrinBs/EphBs 通路相关蛋白表达水平的比较 与空白组比较，PHN模型大鼠脊髓组织中EphrinBs/EphBs通路相关蛋白EphrinB2 和EphB2 蛋白表达水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，给予桃红四物汤治疗后大鼠脊髓组织中EphrinB2和EphB2蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05）；与治疗组比较，给予EphBs 阻滞剂EphB2-Fc 后大鼠脊髓组织中EphrinB2 和EphB2 蛋白表达水平均降低；给予EphBs激动剂EphrinB2-Fc后大鼠脊髓组织中EphrinB2 蛋白表达水平明显降低，而EphB2 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），见图1、表4。

Fig.1 Western blot analysis of EphrinB2 and EphB2 protein expression in spinal cord图1 Western blot检测脊髓组织中EphrinB2和EphB2蛋白表达

Tab.4 Comparison of protein expression levels of EphrinB2 and EphB2 in spinal cord of rats between six groups表4 6组大鼠脊髓组织中EphrinB2和EphB2蛋白表达水平比较 （n=10，±s）

Tab.4 Comparison of protein expression levels of EphrinB2 and EphB2 in spinal cord of rats between six groups表4 6组大鼠脊髓组织中EphrinB2和EphB2蛋白表达水平比较 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与空白组比较，b与模型组比较，c与阳性组比较，d与治疗组比较，e与治疗+EphB2-Fc组比较，P＜0.05

组别空白组模型组阳性组治疗组治疗+EphB2-Fc组治疗+EphrinB2-Fc组F EphrinB2 0.07±0.02 0.35±0.03a 0.12±0.02ab 0.18±0.02abc 0.15±0.02abcd 0.06±0.02bcde 232.345＊＊EphB2 0.23±0.02 0.67±0.04a 0.36±0.03ab 0.45±0.03abc 0.35±0.03abd 0.78±0.06abcde 318.843＊＊

3 讨论

PHN 是一种与脊髓、脊髓上中枢敏化和外周神经敏化等有关的顽固性病理性神经疼痛，多见于中老年人。目前，临床上使用的阿片类药、非甾体类抗炎药和三环类抗抑郁药等各种镇痛药对PHN 的治疗效果甚微，且多存在不良反应［8］。PHN 属于中医学“蛇丹愈后痛”范畴，被认为是湿热毒邪内侵，蕴结于内，年老者气血亏虚，毒邪不散所致的气血凝滞，经络不通等。桃红四物汤是活血养血经典方，源自《医宗金鉴》，具有养血、活血祛瘀的功效，由四物汤加桃仁和红花构成，方中熟地与当归养血活血为君药；川芎活血行滞，白芍敛阴养血，红花、桃仁破血行瘀，祛瘀生新，共为臣药［9］。作为中医传统经典方剂，桃红四物汤在治疗PHN方面的作用逐渐引起关注。有研究发现，95例PHN的患者内服桃红四物汤后总有效率为86.9%［10］。另有研究显示，桃红四物汤可通过抑制炎症反应缓解PHN［11］。然而，桃红四物汤改善PHN的具体机制尚不明确。

VZV 感染CV-1 细胞后经皮下注射大鼠左趾蹼是目前研究PHN常用的造模方法［12-13］。本研究采用该方法造模后模型组大鼠机械痛阈值明显降低；给予桃红四物汤7 d 和14 d 后可使机械痛阈值明显升高，表明PHN 大鼠模型构建成功，桃红四物汤具有减轻PHN 疼痛的作用。在PHN 患者血清中炎性因子IL-1β 和TNF-α 水平呈过度表达状态［14-15］，而高水平的TNF-α和IL-1β可通过刺激炎性细胞产生炎性介质，对神经系统造成损伤，进而引起疼痛。崔玉蓬等［16］研究发现，桃红四物汤可通过降低IL-1β 和TNF-α水平有效减轻急性腰椎间盘突出症患者疼痛的症状。本研究结果显示，PHN 模型大鼠脊髓中IL-1β 和TNF-α 水平较空白组明显升高，而以桃红四物汤治疗后IL-1β 和TNF-α 水平明显降低，提示桃红四物汤可通过降低脊髓中IL-1β和TNF-α水平减轻炎症损伤，改善PHN大鼠疼痛。在神经病理性疼痛发生过程中，神经细胞凋亡是疼痛发生的重要机制［17］。de Novellis 等［18］研究证实，抑制脊髓背角凋亡状态，可减轻疼痛。陈云婷等［19］研究指出，在构建的PHN 小鼠脊髓组织中凋亡执行因子Caspase-3表达升高，脊髓神经细胞凋亡明显增多；夏天无注射液可通过抑制小鼠脊髓神经细胞凋亡发挥改善PHN脊髓疼痛的作用。本研究结果显示，PHN 模型大鼠脊髓中Caspase-3 活性和神经细胞凋亡指数较空白组明显升高；给予桃红四物汤治疗后，Caspase-3 活性和神经细胞凋亡指数明显降低，提示桃红四物汤可抑制脊髓神经细胞凋亡，可能是其改善PHN疼痛的重要机制。

EphrinBs/EphBs 通路的激活可通过促进脊髓后角广动力范围型神经元和伤害性脊神经节兴奋，诱导中枢致敏；同时，还可使下游丝裂原活化蛋白激酶通路活化，在伤害性信息调制方面发挥着重要作用［6，20］。本研究结果显示，PHN 模型大鼠脊髓组织中EphrinBs/EphBs 通路相关蛋白EphrinB2 和EphB2蛋白表达水平较空白组明显升高，给予桃红四物汤治疗可明显降低EphrinB2 和EphB2 蛋白表达水平，提示桃红四物汤可抑制PHN 模型大鼠脊髓组织中EphrinBs/EphBs 通路活化。Liu 等［21］研究显示鞘内注射EphBs 激动剂EphrinB2-Fc 使EphrinBs/EphBs通路激活，可升高IL-1β和TNF-α水平，加重炎症损伤；反之，以注射EphBs 阻滞剂EphB2-Fc 抑制EphrinBs/EphBs 通路活化可降低IL-1β 和TNF-α 水平，减轻炎症损伤。杨梅等［20］研究发现，以鞘内注射EphrinB2-Fc 可使脊髓背角Caspase-3 活性升高，脊髓背角神经元的凋亡增多，疼痛阈值降低；而EphB2-Fc 可使脊髓背角Caspase-3 活性降低，脊髓背角神经元的凋亡减少，疼痛阈值升高，提示桃红四物汤可能通过抑制EphrinBs/EphBs通路活化减轻脊髓组织炎症损伤和神经细胞凋亡而发挥缓解PHN疼痛的作用。本研究在给予桃红四物汤治疗的基础上进一步在鞘内注射EphB2-Fc 和EphrinB2-Fc，以评价EphrinBs/EphBs在桃红四物汤改善PHN疼痛中的作用，结果显示，EphB2-Fc 在阻滞EphrinBs/EphBs 通路活化的同时，还可使桃红四物汤减轻PHN 大鼠疼痛的作用进一步增强，脊髓中IL-1β 和TNF-α 水平进一步降低，脊髓神经细胞凋亡指数和Caspase-3活性进一步降低；反之，给予EphrinB2-Fc处理后，则呈现出与EphB2-Fc 相反的结果，提示EphB2-Fc 可增强桃红四物汤对PHN 大鼠的改善作用，而EphrinB2-Fc 可逆转桃红四物汤对PHN 大鼠的改善作用；桃红四物汤可通过抑制EphrinBs/EphBs 通路减轻脊髓炎症损伤和神经细胞凋亡，进而发挥减轻PHN大鼠疼痛的作用。