QuEChERS-固相萃取-气相色谱/四极杆飞行时间质谱法快速测定牛奶中的11种有机磷

陈锦杭，冯城婷，林秋凤，义志忠，郑耀林，张树权，区硕俊，曾广丰

(1.东莞市食品药品检验所，广东 东莞523808；2.广州检验检测认证集团有限公司 国家加工食品质量检验中心，广州511447；3.广州海关技术中心 广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广州510623)

0 引言

有机磷农药是一种杀虫剂，具有杀毒效果高、广谱性强等特点，在蔬菜和水果种植中受到了广泛的应用[1-4]。其中在水果和蔬菜中均有广泛的应用[5-7]。长期低剂量的暴露可能引发神经毒性、遗传毒性、生殖发育毒性等多种不良影响[8-9]。有机磷残留物也可能会通过牛羊等牲畜的饲料进入动物体内，从而在动物源性的食品中残留，进一步被人体摄入[10]。

目前，对有机磷类农药的测定方法主要有气相色谱法[11-12]、气相色谱-质谱法[13-14]，液相色谱[15]和液相色谱-串联质谱法[16-19]，还有酶联免疫法[20]。本文基于QuEChERS和固相萃取（SPE）技术建立了测定牛奶中的11种有机磷农药的GC-Q-TOF/MS法，该方法操作简便、快速高效且回收率高、重现性好，适用于实验室的日常分析测定，为相关检测方法的研究提供了参考依据。

1 实验

1.1 仪器与试剂

气相色谱-四级杆/飞行时间质谱（安捷伦7200B），配有电子轰击离子源（Electron ionization,EI）及Qualitative Analysis B.07.00,Q-TOF Quantitative Analysis数据处理系统安捷伦科技(中国)有限公司；超纯水系统（Milli-Q Advantage A10），法国Merck Millipore公司；摇床（Promax 2020），德国Heidolph Brinkman公司；高速离心机（TGL-16M），湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；涡旋振荡器（Heidolph Multi Reax），德国Heidolph公司。

乙腈、乙酸乙酯（色谱纯），赛默飞世尔公司；柠檬酸钠，无水硫酸镁，氯化钠，柠檬酸氢二钠（分析纯），安谱公司。

速灭磷、甲拌磷、二嗪磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、水胺硫磷、溴硫磷、杀扑磷、p,p'-DDE、三唑磷、p,p'-DDT（固体标样，纯度≥98.5%）标准品，购自上海安谱科学仪器有限公司）。

1.2 标准溶液的配置

标准储备溶液：分别称取11种标准物质0.0100 g，甲醇定容至10 mL容量瓶，分别配制成1 000 mg/L的标准储备溶液。

混合标准中间液：分别准确移取100μL质量浓度1 000 mg/L的标准储备溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为10 mg/L的混合标准中间液。

混合标准工作曲线：分别取上述混合标准中间溶液10，20，50，100，200，500μL于10 mL容量瓶中，用空白基质液稀释至刻度，所得混合标准工作曲线质量浓度分别为10，20，50，100，200，500μg/L。

1.3 样品前处理

提取：称取牛奶样品10.0 g，依次加入10 mL乙腈，1.0 g柠檬酸钠，4.0 g无水硫酸镁，1.0 g氯化钠，0.4 g柠檬酸氢二钠，置于摇床震荡15 min，然后以转速10 000 r/min离心5 min。吸取上清液5 mL到氮吹管，40℃氮吹至近干，加入2 mL乙酸乙酯，涡旋混匀，继续氮吹至近干，再加入1 mL乙酸乙酯，涡旋，氮吹至0.5 mL。

净化：用4 mL的乙酸乙酯活化GCB固相萃取小柱（3 mL，250 mg），把浓缩的样液加到GCB柱，用3 mL的乙酸乙酯分3次洗脱，收集洗脱液，40℃氮吹至近干，用乙酸乙酯定容至1 mL，过0.22μm有机相滤膜，供仪器测定。

1.4 色谱及质谱条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：安捷伦DB-5ms石英毛细柱(30 m×0.25 mm，0.25μm，购于安捷伦上海公司)；升温程序：80℃保持1 min，以5℃/min升至180℃，保持7 min，以10℃/min升至260℃保持2 min，以20℃/min升至300℃保持9 min；载气(He)流速1.5 mL/min，接口温度为295℃，进样量1μL；不分流。

1.4.2 质谱条件

电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV；四极杆温度150℃；离子源温度280℃；溶剂延迟为5 min；工作模式：全扫描；质量扫描范围：m/z 60～550 amu；扫描速率：5 spectra/s，高分辨模式。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

由于分析化合物较多，尽管高分辨飞行时间质谱定性能力较强，但对于某些化合物，如同分异构体2,4-DDT和4,4-DDT，有可能产生相同的碎片离子，从而影响定量的准确性，所以有必要对化合物进行分离，同时也是为了降低基质效应对定量结果的影响。本实验比 较了DB-5ms、HB-5ms以及PH-5ms色谱柱，使用HB-5ms和PH-5ms的色谱柱难以分离水胺硫磷和溴硫磷，而且峰型较差，难以满足分析的要求。本实验最后发现DB-5ms色谱柱分离效果最好，9种有机磷能同时分离，且具有良好的分离度，满足检测的要求，因此本实验选用DB-5ms。由于水胺硫磷、杀螟硫磷和杀扑磷比较难分离，本研究调整了升温程序，使用2个升温梯度，成功对9种有机磷同时进行分离，并成功获得良好的分离效果，11种有机磷提取色谱如图1所示。

图1 11种有机磷目标物酯的提取离子流色谱

2.2 GC-Q-TOF/MS分析方法的建立

本实验先通过全扫描模式，对11种目标有机磷农药进行采集，得到全扫描质谱图，建立了TOF全扫描精确质量数的数据库。同时确定每种化合物的保留时间，两者结合进行准确的定性分析。再根据目标农药碎片离子的丰度确定定量离子，同时选择特征离子组合（见表1）进行SIM模式扫描。根据其标准物质和待测样品的SIM离子流图中的峰面积，最后通过外标法定量分析。

表1 11种有机磷农药的质谱峰碎片参数

2.3 固相萃取柱类型的选择

牛奶样品中含有较多的糖、蛋白质、氨基酸和干扰性杂质，对11种有机磷目标物产生较大的基质效应，从而干扰实验的进行。本研究采用GCB、PSA和C18固相吸附剂对处理后的溶液进行净化。实验结果显示，11种有机磷目标物中，有一部分具有胺基结构，因此PSA对其具有较明显的吸附作用，导致回收率降低，其次是C18，对11种有机磷也有一定的吸附作用。而GCB对目标物的吸附较少，并且能较好地去除基质对分析结果的影响，基质效应也较弱。本实验最终选取GCB进行净化，结果如图2所示。

图2 不同固相萃取柱对回收率的影响(n=6)

2.4 乙腈用量对回收率的影响

实验前期优化时发现，摇床振摇15 min以上基本完成提取，因此不对提取时间作详细探究。在以纯水用量为5 mL的条件下，对乙腈用量对回收率的影响进行了探究，并以11种有机磷的平均回收率为考察依据。结果发现，当乙腈用量为10 mL时，11种有机磷的回收率基本满足测定要求，而用量继续增加，回收率没有明显变化。虽然乙腈用量越多，稀释倍数越大，因此基质效应也会相对较弱，但同样方法检出限也会越高，氮吹时间，检测成本等也会消耗较大。因此，综合考虑，选取10 mL为乙腈提取用量。结果如图3所示。

图3 乙腈用量对回收率的影响(n=6)

2.5 基质效应的讨论

由于牛奶中含有大量的糖和氨基酸，还有其他杂质，在提取过程中，会被提取到乙腈层，同时也难以在净化过程中完全除去，因此会在质谱分析的过程中，与目标物进行离子化竞争，从而有可能影响目标物的离子化程度而产生基质效应。本文以空白基质曲线的斜率与纯溶剂曲线的斜率比值K为参考依据，以讨论方法的基质效应程度，当K值在0.9～1.1之间时，说明基质效应不明显；K值小于0.9时，基质负效应明显；K值大于1.1时，基质正效应明显；实验结果表明，12种有机磷的K值在0.56～0.81之间，说明基质负效应较明显，因此，最终选择采用基质曲线进行定量。

2.6 线性关系

本研究使用外标法，对11种目标物进行定量分析。以空白基质溶液来配制标准系列曲线，在经优化后的仪器条件下进行测定。测得结果以浓度为横坐标(X)和定量离子对的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，实验结果表明，所有目标物在10～500μ/L范围内呈良好线性，相关系数R2均大于0.9984。其中，方法检测限LOD（S/N=3）为1.56～7.85μg/kg，定量限LOQ（S/N=10）为5.51～26.89μg/kg。结果如表2所示。

表2 11种有机磷农药的线性方程、相关系数（R2）和检出限

2.7 回收率及精密度结果分析

选用空白样品，以质量分数10，20，50μg/kg，进行3个水平的加标回收实验，每个加标水平分别日内进行6次平行测定。平均回收率范围在73.6%～95.4%之间，相对标准偏差（RSD）在2.48%～6.30%之间。本实验结果说明该11种有机磷的回收率良好，日内重复性好，能满足分析测定要求，结果如表3所示。

表3 11种有机磷农药的回收率和精密度

3 结论

本研究基于QuEChERS技术进行提取，结合SPE固相萃取柱进行净化，使用GC-Q-TOF/MS建立了快速测定牛奶中11种有机磷农药的测定方法。利用GCB对样品提取液进行净化，有效地降低了基质效应对回收率的影响，提高了方法的灵敏度；在优化的气相色谱条件下，11种有机磷农药在35 min内全部出峰，且完全分离，峰型良好；结合GC-Q-TOF/MS，准确测定了11种有机磷定性定量离子对的精确分子量，极大程度的降低了假阳性的可能；相关方法学实验结果表明，本方法简单便捷，回收率好且精密度高，为有机磷类农药残留量的检测方法研究提供了重要参考数据。