牛初乳小分子活性肽对小鼠骨密度及脂肪含量的影响研究

郭瑞峰，刘少伟，姚刚

（1.华东理工大学生物工程学院，上海200237；2.中国科学院上海营养与健康研究所，上海200031）

0 引言

牛初乳是母牛产犊后3天内分泌的乳汁，因其含有较高的蛋白质以及较低的脂肪和糖，与普通牛乳明显不同。20世纪50年代以来，人们发现牛初乳中不仅含有丰富的营养物质，而且免疫因子、生长因子等天然功能因子的含量极为丰富。研究发现这些活性成分一般为蛋白质或多肽，如免疫球蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶、类胰岛素生长因子、表皮生长因子等，它们在免疫调节、改善胃肠道、促进生长发育、改善衰老症状、抑制多种病菌等方面发挥一系列生理功能。由此，牛初乳也被誉为“21世纪的保健食品”[1-4]。初乳作为哺乳动物提供给幼仔的最初食物，其功能性成分保障了动物幼仔的健康成长；而作为功能性食品，则具有很高的应用价值。国内外研究表明，牛初乳中的生理活性成分在免疫调节、延缓衰老、促进生长发育及抑制肿瘤等方面，不仅可以用来制造功能性食品，而且还具有开发成天然活性生物药物的巨大潜力[5-8]。

目前，人们研究较多的乳源性生物活性肽主要有阿片肽、抗菌肽、抗高血压肽、抗血栓肽、免疫调节肽、酪蛋白磷酸肽，以及近些年兴起的富脯氨酸多肽等，多集中于分子量较大的活性分子，而对小分子多肽的研究却鲜有报道。在前面的研究中，我们采用脱脂技术结合超滤膜法物理分离牛初乳中不同区段的蛋白片段，得到了天然的小分子蛋白多肽，并证实而其中3 ku以下的蛋白片段对不同种类细胞的生长都有一定的促进作用[9]。如，对HFL-Ⅰ细胞的生长具有很明显的促进作用，并且对HFL-Ⅰ细胞、293细胞以及HL-7702细胞的生长均呈现出一定的剂量效应关系；同时也验证了超滤膜法分离得到的蛋白片段很好的保留了牛初乳中的活性物质分子。此外,我们在另一项研究中还发现了3 ku以下的小分子多肽具有一定的抑菌作用，并在色谱法分离后经过多肽/蛋白质N-端测序分析，证实为β-酪蛋白片段。因此，我们初步认定牛初乳中分子量低于3 ku的小分子蛋白多肽具有一定的功能作用。为了进一步探讨牛初乳中小分子蛋白多肽对个体生长的促进作用，将分离获得的不同区段的蛋白片段加以收集冻干，并作为膳食补充剂提供给Balb/C小鼠，初步探讨牛初乳活性肽对小鼠生长方面的影响。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 试剂

牛初乳由上海奶牛场提供；冰醋酸、无水乙醇购自上海国药集团。

1.1.2 主要仪器SY-MU2010切向流超滤系统为上海世远生物设备工程有限公司产品；KY-I微型空气压缩机，上海精胜科学仪器有限公司；ThermoLL3000冷冻干燥机；超净工作台，苏州净化设备有限公司；Thermo ST8R高速冷冻离心机；双能X线骨密度仪，美国Hologic公司产品。

1.1.3 实验动物Balb/C雄性小鼠。

1.2 方法

1.2.1 实验流程

新鲜牛初乳解冻→离心脱脂→调节pH去除酪蛋白→酒精去除白蛋白→过滤→超滤收集3 ku以下、3～10 ku及10 ku以上三个区段→冻干处理→动物实验

1.2.2 牛初乳的预处理

牛初乳首先经4℃、5 000g离心15 min进行脱脂处理，去除上层脂肪、大颗粒蛋白及杂质沉淀；然后加入蒸馏水对倍稀释，用冰醋酸调pH至4.0，45℃水浴30 min，并充分搅拌混匀，再经8 000g、4℃离心10 min，去除酪蛋白沉淀，取上清蛋白溶液；再根据牛初乳的体积加入20%的酒精，沉淀白蛋白，于4℃以8 000g离心20 min，弃下层的蛋白沉淀，取出上层清液。

1.2.3 超滤离心预处理过的牛初乳获取不同区段蛋白

利用30 ku超滤离心管，在20℃、4 000g条件下离心20 min，收集上层蛋白溶液(含30 ku以上蛋白)；然后把下层蛋白溶液转入10 ku超滤离心管，在20℃、4 000 g条件下离心20 min，收集上层蛋白液体(含10～30 ku蛋白)；再把下层蛋白溶液转入3 ku超滤离心管，在20℃、4 000g条件下离心20 min，分别收集上层(含3～10 ku蛋白)和下层(含3 ku以下蛋白)蛋白液体，这样就得到了不同区段的蛋白溶液，包括30 ku以上蛋白、10～30 ku区间的蛋白、3～10 ku区间的蛋白以及3 ku以下的蛋白。

1.2.4 牛初乳中不同区段蛋白样品的收集

把收集的不同区段的蛋白溶液及去除的酪蛋白分别放入茄型瓶中，冻干后收集、称重，记录获得的质量数据。

1.2.5 骨密度及脂肪含量试验

（1）动物分组。

本实验采用3周龄断奶的Balb/C雄性小鼠。84只小鼠随机分成10组，每组8只(对照组为4只)，分别为牛初乳3 ku以下10倍日服量组；牛初乳3 ku以下30倍日服量组；牛初乳3～10 ku 10倍日服量组；牛初乳3～10 ku 30倍日服量组；牛初乳10 ku以上10倍日服量组；牛初乳10 ku以上30倍日服量组以及对照组。

（2）实验剂量设计。

牛初乳人体推荐日服量为2 g/(60 kg·bw)，即0.035 g/(kg·bw)。设人体推荐日服量为1倍日服量，则实验中小鼠的日服量为10倍（人体）日服量和30倍（人体）日服量。

以实验开始阶段每只小鼠体重为12 g计，则每只小鼠日服牛初乳0.00042 g（1倍日服量）。10倍日服量组每只小鼠服用牛初乳0.0042 g；30倍日服量组每只小鼠服用牛初乳0.0126 g。

每只实验小鼠每日摄水量约为2.5 mL/(10 g·bw)。以实验开始阶段每只小鼠体重为12 g计，则每只小鼠日摄水量为约为3 mL。10倍日服量组牛初乳浓度为0.0042 g/3 mL，即0.0014 g/mL；30倍日服量组牛初乳浓度为0.0126 g/3 mL，即0.0042 g/mL。则实验剂量最终为10倍组：0.28 g+200 mL水；30倍组：0.84 g+200 mL水。

（3）喂养方式。

将牛初乳不同区段按照上述剂量溶解于蒸馏水中配制成不同浓度的溶液供小鼠自由取食（对照组不加任何溶质，为普通蒸馏水），实验用水由实验小鼠自由摄取，平均每4 d换一次水，正常鼠粮供应。整个实验过程持续60 d。60 d后处死实验小鼠，对其进行骨密度及脂肪含量的评估。

（4）检测方法。

服用60 d后将小鼠送上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科通过Hologic双能X线骨密度仪活体检测小鼠骨密度值(BMC单位：g/cm2)及脂肪含量。

1.2.6 统计学方法

采用GraphPad Prism7统计软件进行one-way ANOVA处理分析。资料数据以(x)±标准差(s)表示，以P＜0.05为有统计学意义，但作为探索性研究，本次统计把检验水平放宽到0.1。

2 结果与分析

2.1 牛初乳中不同区段的蛋白的收集

每50 mL牛初乳得到样品质量如表1所示。其中3 ku以下蛋白多肽的相对含量较少，低于总量的10%。

表1 不同区段蛋白的质量

酪蛋白是牛初乳中的一种大分子蛋白，且占有相当大的比例。我们在制备小分子蛋白片段时，通过调节pH值至4.0，并加温至45℃，同时搅拌混匀，之后再进行离心，较佳的去除了酪蛋白分子；牛初乳中的酪蛋白去除后，剩余的蛋白主要为白蛋白，可通过酒精法形成蛋白沉淀进行去除，之后便可通过超滤法进一步分出各个不同的蛋白区段。

2.2 牛初乳各区段蛋白对小鼠骨密度的影响

牛初乳各个区段实验组和对照组骨密度的均值情况如图1所示。

图1 牛初乳各区段蛋白对Balb/C小鼠骨密度的影响

各实验组与对照组间经统计学方法分析后得到的P值 依 次 如 下：0.1993，0.0634，0.3916，0.0756，0.0756，0.3460，虽然均大于0.05，但3 ku以下30倍组、3～10 ku 30倍组和10 ku以上10倍组的P值小于0.1，表明差异具有一定的意义。另外，专业意义上的差异是否显著，我们做了如下分析。

计算公式：

骨密度增幅=（各组指标平均值-对照组指标平均值）/对照组指标平均值×100%

则牛初乳3 ku以下10倍组骨密度增幅为4.65%；牛初乳3 ku以下30倍组：6.77%；牛初乳3～10 ku 10倍组：3.59%；牛初乳3～10 ku 30倍组：7.04%；牛初乳10 ku以上10倍组：4.91%；牛初乳10 ku以上30倍组：4.12%，结果如图2所示。

图2 各区段蛋白对Balb/C小鼠骨密度提升的幅度

由骨密度增幅结果可见，牛初乳的各个区段对于实验小鼠骨密度值的增长都体现出良好的促进作用。在低剂量组方面，牛初乳3 ku以下10倍组小鼠的骨密度值略高于牛初乳3～10 ku 10倍组；而在高剂量组方面，牛初乳3 ku以下30倍组和牛初乳3～10 ku 30倍组的效果尤为突出，达到了近7%左右的增幅，具有较强的专业意义。

2.3 牛初乳各区段蛋白对小鼠脂肪含量的影响

牛初乳各个区段实验组和对照组小鼠脂肪含量的均值情况如图3所示。

图3 各区段蛋白对Balb/C小鼠脂肪含量的影响

用统计学方法计算各实验组间及实验组与对照组间P值情况，其中牛初乳3 ku以下10倍组与牛初乳10 ku以上10倍组和10 ku以上30倍组间差异显著，P值分别为0.0193和0.0210，P＜0.05具有统计学意义。此外，牛初乳3 ku以下30倍组与牛初乳10 ku以上10倍组和10 ku以上30倍组间P值分别为0.0561和0.0606，虽然大于0.05，但却小于0.1，差异具有一定意义。而且专业意义上仍呈现出较为显著的差异。

计算公式：

脂肪量增幅=（各组指标平均值-对照组指标平均值）/对照组指标平均值×100%

牛初乳各个区段实验小鼠的脂肪含量增幅如下，牛初乳3 ku以下10倍组：-2.29%；牛初乳3 ku以下30倍组：-1.78%；牛初乳3～10 ku10倍组：4.83%；牛初乳3～10 ku30倍组：21.63%；牛初乳10 ku以上10倍组：27.23%；牛初乳10 ku以上30倍组：27.23%，结果如图4所示。

图4 各区段蛋白对Balb/C小鼠脂肪含量影响的幅度

分析结果表明，在对小鼠脂肪含量的影响方面，牛初乳3 ku以下实验组与对照组相比均有所减少，其余各组的脂肪水平则都有不同程度的上升。牛初乳3～10 ku以及10 ku以上组小鼠的脂肪含量明显高于对照组及3 ku以下组，而其中牛初乳10 ku以上2个组的变化结果尤为突出，达到了近30%的增幅，在专业意义上差异显著。

3 讨论

牛初乳3～10 ku区段中含有大量胰岛素样生长因子I（IGF-1）。IGF-1也 被称作“促 生长因子”（somatomedin C），是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质。作为人体内非常重要的细胞有丝分裂促进剂，IGF-1对于人体的生长发育有良好的促进作用[10-11]，体现在能促进骨的基质合成，抑制骨骼的分解代谢，防治骨骼中钙的流失，维持骨骼的正常结构和功能等方面，因此在防治骨质疏松症中效果明显。然而，当今业界对于IGF-1的功效却众说纷纭，其中负面声音主要针对IGF-1具有致癌作用。有事件表明，在女性摄入大量IGF-1后乳腺癌发病率明显地提高[12-13]。虽然目前还没有确切的证据确认IGF-1是癌症的诱因之一，然而从健康的角度考虑，减少IGF-1的摄入仍是安全的做法。

牛初乳3 ku以下区段中则不含有IGF-1成分[9]，但在本实验中对于小鼠的骨密度提高方面却表现出和含有IGF-1的3～10 ku区段相当的效果。由此可见，其中的生物活性肽具有良好的促生长作用，并且由于天然牛初乳中生物活性肽的绝对安全性，使其体现出巨大的市场应用潜力。

本实验采用三周龄断奶的Balb/C雄性小鼠作为实验对象，通过在小鼠平日饮用水中添加物质组分来研究牛初乳不同剂量的各区段蛋白对骨密度和脂肪含量等生长发育指标的作用与影响[14]。骨密度反映的是骨质疏松程度，是衡量骨骼质量最重要的指标；而骨骼质量则又充分反映了生长发育的实际情况。因此，实验结果中骨密度的变化会反映出牛初乳对于促进生长发育的影响程度。从实际的实验结果来看，牛初乳各个区段实验组小鼠的骨密度值（BMD）均高于对照组的数据。尤其是3 ku以下30倍组、3～10 ku 30倍组和10 ku以上10倍组与对照组间的P值均小于0.1，虽未达及0.05，但也体现出一定的意义。另外，实验结果中30倍日服量组对于骨密度值的提升程度相比于10倍日服量组为大，证明了牛初乳的效用是依赖于剂量的，且仅从10倍日服量至30倍日服量范围内来看，剂量越高，对骨密度值增加的效果越明显。

脂肪水平是衡量身体健康的重要指标之一，脂肪水平含量过高，身体健康状况就会降低。牛初乳3 ku以下区段在促进生长发育的同时并没有以脂肪水平的升高作为代价，而是很好地控制住了脂肪的增长。实验中3 ku以下10倍组与10 ku以上10倍组和10 ku以上30倍组间差异显著，P＜0.05具有统计学意义。且3 ku以下30倍组与10 ku以上10倍组和10 ku以上30倍组间P值小于0.1，差异具有一定意义。由此可见，在控制脂肪水平方面，牛初乳3 ku以下区段要优于牛初乳10 ku以上区段，其对于生长的促进作用是安全、有效以及可靠的。

牛初乳3 ku以下区段在促进生长发育中的作用未见过报道，所以，作为探索性研究，本次统计把检验水平放宽到0.1。若干组数据P值虽未达到小于0.05，但却达到了小于0.1，而且显示出了较为明显的专业意义上的差异，预示着这是一个值得进一步探索的方向。同时，我们认为这一点也可能是由于样本量相对不足所致[15-17]，拟在后继的研究中通过进一步增加实验动物的数量加以完善。

综上所述，通过超滤膜法可以很好的分离并得到牛初乳中各个区段的蛋白；牛初乳的三个区段的组分对小鼠骨密度值的增长均体现了良好的促进作用，尤其是3 ku以下和3～10 ku区段的高剂量组效果最为明显；而在对脂肪含量的影响方面，3 ku以下区段的小分子多肽则具有最积极的作用，值得进一步开发和利用。

构成蛋白质的氨基酸虽然只有20种，但由它们排列组合所形成的肽的品种在理论上可以达到天文数字。因此，生物活性肽的资源十分广阔，是一座亟待人类去开发挖掘的天然宝库。然而，目前本领域对于动物初乳的研究局限于其中的大分子生物活性物质，对于小分子物质成分却乏人问津。因此，还需进一步在生物活性肽小分子组分上对牛初乳加以研究，以期开发出动物初乳的新制剂，提高动物初乳原料的利用率。这方面的探索必将对人类的健康事业产生巨大的推动作用，并带来新的经济价值和社会价值。