添加胃肠肽奶粉的抗过敏功效及对胃肠肽自分泌的影响

谢咏梅，汪志凌，王丽媛，高珊，蔡晓唐

（四川大学 华西第二医院儿科出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室，成都610041）

0 引言

生长抑素（Somatostatin，SST）与胃动素（Motilin，MTL）是经典的“抑制性”与“兴奋性”胃肠肽代表，对“胃肠-神经-内分泌-免疫”功能有着广泛调节作用。既往的研究发现，母乳中有高浓度的SST及MTL分泌，并可能参与婴儿胃肠功能维护、抑制过敏及诱导“食物免疫耐受”[1]。牛乳过敏症在婴幼儿的发病率呈显著升高趋势，降低牛奶粉的过敏性研究有着积极的医学及社会意义。本着模拟母乳原则，本研究在普通婴儿牛乳奶粉中添加“等同母乳剂量”的SST及MTL，探索添加胃肠肽的奶粉对“牛乳过敏症及食物不耐受”是否有预防功效及降低风险作用。并了解在添加SST及MTL后的奶粉对幼崽自身胃肠肽分泌的影响，观察其有否显著临床副作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象与干预处理

采用BN（Brown Norway）大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。BN大鼠于四川大学实验动物中心SPF级动物房常规饲养。生后一周左右的BN大鼠幼仔，按性别及体重分级，随机分配到3组。每组15只幼鼠，给与不同干预方式喂养，详见表1。

添加胃肠肽的牛乳奶粉配置方法：牛乳奶粉按说明书配置成牛乳。牛乳中添加胃动素至终浓度为250 ng/L（猪胃动素，广州和为医药科技有限公司），并同时添加天然14肽生长抑素至终浓度为400 ng/L（思他宁，瑞士雪兰诺公司，Laboratoires Serono S.A.）。

1.2 酶联免疫法ELISA测定血总免疫球蛋白E（Total IgE，T-IgE）水平

所有实验组BN幼鼠在进行不同干预喂养处理后，于第29天以1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉。抽取静脉血5 mL，800g离心分离制备血清，-20℃冻存待检。采用双抗体夹心ELISA法检测血清T-IgE水平，检测过程按大鼠血清总IgE试剂盒（RapidBioLab,USA）说明书操作。Model 680酶标仪（Bio-Rad公司，美国）测定650 nm吸光度，绘制标准曲线并计算检测样本终浓度。

1.3 临床损害评分（叠加量化法）

各组大鼠每天观察状况，共计干预喂养4周。按表2标准，分别进行精神行为状况、消化道症状、体重增长情况及皮疹状况等临床症状评分，最后采用“叠加量化法”评价总体临床损害程度。临床损害总评分=皮肤损害评分+消化道症状评分+精神行为损害评分+体重落后评分。每周评分一次，连续4周动态评分，评分越高者临床损害越重。

1.4 胃肠动力检测

采用“葡聚糖蓝法”检测胃肠动力[2]。各组大鼠给予不同干预方式喂养至28天。第29天禁食禁饮半天后，给予胃管灌入2%葡聚糖蓝-2000（四川省维克奇生物科技有限公司）0.4 mL。半小时后处死动物，测定“胃排空比率”及“小肠推进比”。于贲门及幽门处结扎胃体出入口，向胃体内针管注入蒸馏水3 mL，清洗胃腔，收集胃内液体，在620 nm波长下（Model 680,Bio-Rad Co.,USA），测定胃内色素残留物吸光度。胃排空比率（%）=（母乳喂养组吸光度的均值/各样本吸光度）×100%。小肠推进比（%）=（幽门括约肌至色素最前端距离/幽门至盲肠始端总距离）×100%。

1.5 酶联免疫法测定血及大便中SST及MTL含量

大便标本处理：干预处理满4周时，于处死大鼠前一天收集新鲜大便标本，冻存于-80℃保存待检。取大便标本200 mg，加2 mL生理盐水，100℃煮沸3 min，加入0.1 mol/L盐酸0.5 mL，超声匀浆，4℃孵育1～2 h，加入0.1 mol/L NaOH 0.5 mL中和；4℃低温离心3 000 rpm×30 min，取上清液；考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，蛋白液-80℃冻存待检。

表1 各实验组干预处理措施

表2 临床损害量化评分表

血液标本处理：在处死大鼠前收集动脉血标本5 mL，加入含有7.5% EDTA二钠30μL和抑肽酶40μL的聚苯乙烯试管内，静置2 h后，离心3 000 rpm×15 min，离心半径8 cm，取上清液分离血浆，冻存于-80℃保存。取血浆2 mL，加入2 mL生理盐水，100℃煮沸3 min，加入0.1 mol/L盐酸0.5 mL，4℃孵育1～2 h，加入0.1 mol/L NaOH 0.5 mL中和；4℃低温离心（3 000 rpm）30 min，取上清液；考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，蛋白液-80℃冻存待检。

采用双抗体夹心ELISA法检测血浆及大便中MTL及SST含量。大鼠胃动素ELISA试剂盒及大鼠生长抑素ELISA试剂盒购自上海信裕生物技术有限公司。检测过程按试剂盒说明书操作。Model 680酶标仪（Bio-Rad公司，美国）测定450 nm波长下吸光度（OD值），绘制标准曲线并计算检测样本终浓度。每份标本取2份检测2次，最后结果以检测值的均值表示。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0及Graph Pad Prism 8软件对数据进行统计分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示。多个组别之间比较，先采用方差分析（F检验）比较总体差异性，再采用q检验进行各组别之间两两比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 血总免疫球蛋白E（Total IgE，T-IgE）水平

ELISA法测定各实验组大鼠血中总IgE（T-IgE）水平，见表3。在胃肠喂养及皮肤涂抹致敏刺激下，牛乳组的T-IgE水平较母乳组有显著升高（q=112.40，P＜0.0001），提示牛乳激发了显著的过敏反应。牛乳中添加了胃肠肽后，SST+MTL组的T-IgE较之牛乳组有显著降低（q=77.96，P＜0.0001）。

表3 血总IgE、临床损害及胃肠动力状况（n=15）

2.2 临床损害评分（叠加量化法）

干预喂养4周后，牛乳组的临床损害最重，有皮疹、腹泻、血便、食纳减退、体重增长缓慢等临床症状。SST+MTL组第4周时的临床损害状况显著轻于牛乳组（q=13.24，P＜0.0001），见表3。SST+MTL组的临床损害总评分在每周的评估中均为最低，见图1。

严重并发症情况：在牛乳喂养及皮肤涂抹诱导致敏下，第4周时牛乳组有轻中度皮炎及不同程度的腹泻、便血症状，其他组别的总体临床损害均轻于牛乳组。所有实验组均未发生失血性休克、肠梗阻、重症喘息、死亡等严重并发症。

图1 临床损害状况评分（分值）

2.3 胃肠动力检测

以母乳喂养组的胃排空值作为基线对比，牛乳组及SST+MTL组的胃动力状况均低于母乳组（见表3）。牛乳组的胃动力最差（vs.母乳组及vs.SST+MTL组，q值分别为16.93及11.51，P＜0.0001）。尽管SST+MTL组的胃动力较之母乳组也有降低，但显著优于牛乳组。小肠推进比情况，牛乳组的小肠蠕动明显加快，这与牛乳组有明显腹泻症状相符合（牛乳组vs.母乳组，q=27.30，P＜0.0001）。SST+MTL组的腹泻症状明显轻于牛乳组，其小肠动力状况也非常接近BF组，两组间无显著差异性（q=0.3513，P=0.9991）。

2.4 血及大便中SST及MTL含量

牛乳组的血SST及血MTL浓度，较之母乳组及SST+MTL组，尽管在统计学上有显著差异（P＜0.0001），但其倍比降幅并不大，仅低下20%左右（见表4及图2）。较之牛乳组，SST+MTL组的血SST及血MTL浓度均有上升，其水平接近母乳组，且同母乳组

图2 血及大便中SST及MTL水平的倍比率（比值率）

无显著性差异（P＞0.05，见表4）。大便中的SST/MTL浓度，牛乳组显著低于母乳组及SST+MTL组（P＜0.0001），且倍比降幅显著，仅约另两组浓度的30%左右（见表4及图2）。SST+MTL组的大便中SST/MTL浓度较之牛乳组有显著提升，且接近母乳组状况（vs.母乳组，P＞0.05）。

表4 血及大便中SST及MTL含量（ELISA法，n=15）

3 结果与讨论

胃动素（MTL）与生长抑素（SST）是经典的兴奋性与抑制性胃肠肽类激素代表[3]，有着广泛的“胃肠/神经/免疫”等调节作用。二者的大分子前体均有物种差异，但裂解后的活性部分却高度保守并跨物种[4-5]。SST与MTL在婴儿期处于生理性低分泌状态。而孕晚期及产后乳母的血浆中SST及MTL分泌水平有显著增高，母乳中也有高浓度的MTL与SST分泌[1,6-7]，但母乳中活性胃肠肽的生理学功能尚不明确。

本研究采用高过敏、高IgE反应的BN大鼠，牛乳喂养诱导“食物过敏/食物不耐受”模型[8]，并在牛乳中添加“等同母乳剂量”的SST及MTL，以探讨SST/MTL的功能作用。普通牛乳组诱导出了明显的消化道及皮肤症状，且血总IgE水平显著升高，并有胃动力下降、肠蠕动过快的动力紊乱现象，提示造模成功。添加SST+MTL后的牛乳组，较之普通牛乳组，血总IgE水平显著下降约50%，临床损害评分也显著降低约40%。SST+MTL组的胃肠动力状况也更接近母乳组，体重增长优于牛乳组。可见，添加SST+MTL对牛乳过敏有确定的预防作用，且能提高普通牛乳的胃肠道耐受性，改善生长发育状况。SST+MTL组连续用药4周，无明显副作用显现。SST/MTL的含量测定显示，牛乳组血中的SST/MTL浓度较母乳组有轻度降低，但消化道局部（大便中）的SST/MTL的含量明显低下而缺乏。添加SST+MTL后，消化道局部内的浓度提升显著（约3倍），更接近母乳组状况，而血循环中浓度提升则非常轻微（仅20%左右，见图2）。这显示，食物中添加SST/MTL更多的是在胃肠道局部起作用，对幼崽的自身血循环系统中的胃肠肽水平影响较小。

SST是经典的抑制性胃肠激素代表，对生长发育及胃肠功能均有抑制作用[9]。15年前就发现，婴儿期血中SST水平较成人显著低下（约1/4比例），但婴儿的胃肠道黏膜上“SST受体”表达却十分丰富，这种“受体与配体不平衡”的奇怪表达现象，其生理学意义未知[10]。进场我们又发现，母乳中有丰富的SST分泌，约4倍于人血浓度[1,6-7]，母乳中高浓度的SST应该不是为了抑制婴儿生长，其确切功能尚不明确。同时发现，食物过敏症的纯母乳喂养婴儿，其母乳中SST水平有显著降低。这就联想到了SST另一重要功能——内源性免疫抑制因子。SST对“炎症瀑布级联反应”及“免疫过激损伤”均有显著抑制作用[11-12]，这一作用早已用于重症胰腺炎、多脏器损伤等的临床治疗[13-14]。因此推测，婴儿胃肠道上丰富表达的“SST受体”不是为了感知自身血中低浓度的SST，而是为了感受母乳中的“外源性SST”，SST可能在胃肠道局部起到抑制“食物超敏免疫”，进而诱导“食物免疫耐受”。结合本研究结果，添加SST后的牛乳，对胃肠道致敏性显著降低，消化道免疫损伤有减轻。证明牛乳中添加外源性SST起到了减轻过敏免疫损伤、诱导食物耐受的作用。且食物中的SST主要在消化道内形成局部高浓度，对幼崽自身血浓度影响不大。这将有利于SST作用局限于消化道，利于降低抑制生长的全身性副作用。同时本研究结果显示，添加SST后，对肠动力有抑制作用，但这一作用刚好对抗和缓解了过敏损伤导致的“腹泻及肠易激蠕动过快”。另一方面，SST+MTL组的胃动力更接近母乳组状况，推测可能是MTL拮抗了SST的胃动力抑制作用。

MTL是经典的兴奋性胃肠肽代表，其类似物治疗婴儿“喂养困难”及“食物不耐受”疗效确切[15]。MTL从外周及中枢双重层面调节胃肠动力及食欲[16]，又被称为“增食欲肽”[17]。婴儿期MTL处于生理性低分泌状态[18]。我们曾发现，母乳中也有高浓度的MTL分泌，且母乳中MTL水平低下的婴儿，更易出现腹胀、便秘、食欲低下等功能性消化不良症状。MTL水平低下也与功能性消化不良息息相关[19]。因此推测，母乳给予婴儿必要的外源性MTL补充，可能起到增强婴儿胃肠动力、促进消化酶分泌及促进食欲作用，对于维持婴儿快速生长及支撑过重的胃肠负担有着重要作用，这可能是“母子共生互补”的重要机制。而牛乳喂养婴儿的食物中缺乏外源性MTL补充，这可能助推“喂养困难及食物不耐受”风险。本研究在牛乳中添加MTL后，幼鼠食欲有改善，体重增长也优于纯牛乳组。SST+MTL组的胃动力在SST抑制下，MTL显示出对SST的拮抗平衡作用，其总体胃动力状况较纯牛乳组有显著改善，更为接近母乳组。证明MTL对SST的胃肠抑制作用有拮抗平衡，并对促进食欲、促进生长及预防食物不耐受有着良好作用。可见，在普通牛乳中添加MTL，有助于改善牛乳的胃肠耐受性，对预防婴儿食物不耐受及改善喂养困难有积极作用。而且这一作用多数局限于消化系统内，对幼崽全身血循环水平影响相对较小。

SST及MTL作为两种有拮抗相反作用的胃肠肽，为何在人母乳中同时有高浓度分泌，这也是研究中感到困惑的问题。而本研究结果恰好可以充分揭示二者同时存在的协调机制。胃肠动力结果显示，SST+MTL组的胃肠动力更倾于正常化，更接近母乳组状态，SST与MTL显示出相互平衡协调作用。一方面SST参与抑制食物超敏，诱导食物免疫耐受。另一方面，MTL拮抗SST对胃肠动力的抑制，促进食欲、促进生长，拮抗SST的抑制生长作用。因此推测，天然母乳中的抑制性与兴奋性胃肠肽之间，存在“协同/拮抗”的双重平衡调节机制。而且母乳中的活性SST及MTL可能更多的是在消化道局部发挥作用，对幼崽自身血循环水平影响相对较小，这将有利于降低幼崽的全身性副反应。可见，在普通牛乳奶粉中添加母乳剂量的SST+MTL，能改善婴儿奶粉的消化道耐受性，降低牛乳过敏风险。SST+MTL组的生长发育及体重增长等状况明显优于牛乳组，其一般状况更接近母乳组。SST+MTL组用药4周，显示出良好疗效，且未见明显副作用及并发症。可见，在牛乳中添加“等同母乳剂量”的SST及MTL是安全的，并能显著改善普通牛乳的胃肠耐受性及致过敏性。