不同来源植物乳杆菌的益生特性研究

丁诗瑶，雷文平，刘成国，张岩春，汪家琦，汪镇南，周辉

（1.湖南农业大学 食品科学技术学院，长沙410128;2.澳优乳业（中国）有限公司，长沙410200;3.湖南沙博安科技有限公司,长沙410200）

0 引言

益生菌为具有生物活性，摄入适当量时可以对宿主产生有益作用的微生物[1]。目前研究较多的益生菌生理功能有建立和维持肠道内正常优势种群、营养增强、免疫调节、降胆固醇、抗肿瘤、延缓衰老等[2]。随着生活方式的改变，益生菌的应用扩散到饮食保健的方方面面。目前研究较多的益生菌有双歧杆菌属、乳杆菌属、嗜热链球菌属等[3]，其中，植物乳杆菌在生物环境中分布广泛，且可能具有在不同环境中有效迁移的能力[4]。从非人体环境中筛选的乳酸菌，若要采取摄入的方式对人体产生积极作用，需要经过一系列的探究和鉴定，以确定乳酸菌可以相对长时间存在于人体且发挥其活性。FAO和WHO联合发表《食品中益生菌评估指南》中，研究益生菌的主要试验包括对胃酸的耐受试验、黏附试验、对条件致病菌的拮抗活性试验等[5]。

本研究以实验室保存的不同来源的植物乳杆菌为材料，通过耐受模拟胃肠液、抑菌活性、体外安全性评价、黏附能力等方面进行试验，对这7株植物乳杆菌的益生特性进行初步探究，为其之后作为益生菌应用至食品中提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

大肠杆菌（Escherichia coli）CGMCC 9181由湖南沙博安科技有限公司提供；鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus）ATCC 6538由中国农业大学提供；单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19115及不同来源植物乳杆菌由湖南农业大学食品科技学院乳品加工实验室提供，其中，D04、D05、D12、D18从湖南省南山牧场鲜牛奶中分离，D22、D24、D26从湖南农家自制剁辣椒中分离。

1.1.2 试剂

氯化钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；MRS肉汤培养基、琼脂、血平板，广东环凯微生物科技有限公司；胃蛋白酶（3 000～3 500 U/g），北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白酶（≥50 000 U/g），国药集团化学试剂有限公司；DMEM培养基、PBS，以色列贝特哈梅克生物工业公司；抗生素试剂盒（20种），杭州微生物试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

XW-80A漩涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；GZ-400-S恒温培养箱，韶关市广智科技设备有限公司；SW-CJ-2D双人单面垂直净化工作台，苏州净化有限公司；BKQ-B50II全自动高压蒸汽灭菌锅，山东博科科学仪器有限公司；HH-601超级恒温水浴锅，常州市万丰仪器制造有限公司；TG16-WS台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HF90二氧化碳培养箱，力康生物医疗科技控股有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌悬液的制备

将于-80℃保藏的菌株接种于新鲜无菌MRS肉汤培养基中，37℃培养24 h活化两代后以1%接种量接种至5 mL新鲜培养基中培养24 h，于4℃，10 000 r/min条件下离心2 min，弃上清，将菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤2次后重悬，使菌悬液在600 nm波长处的吸光度值为0.8～0.9。

1.3.2 耐受模拟胃肠液能力

模拟胃液配制[6]：量取1 mol/L HCl溶液20 mL，用NaOH溶液将其pH调至3，加入胃蛋白酶使其终浓度为1 g/100mL，0.22μm微孔滤膜除菌。

模拟肠液配制[7]：取磷酸二氢钾6.8 g，加水500 mL使之溶解，用NaOH溶液将其pH调至6.8；另取胰蛋白酶10 g，加水适量溶解，将两液混合后，加水稀释至1 000 mL，0.22μm微孔滤膜除菌。

将0.5 mL菌悬液加至4.5 mL模拟胃液或肠液中，混合均匀，于37℃条件下孵育3 h，分别计数0 h及3 h时混合液中乳酸菌数量，以菌株存活率评估植物乳杆菌对模拟胃肠液的耐受能力（以鼠李糖乳杆菌GG为阳性对照）。菌株存活率计算公式如下：

1.3.3 胆盐水解酶活性及蛋白水解酶活性

胆盐水解酶活性[8]：在MRS琼脂培养基中加入3 g/L牛磺酸钠，使用接种环将植物乳杆菌发酵液点种到培养基上，37℃培养3 d，观察周围是否有透明圈产生，以评价菌株的胆盐水解酶活性。

蛋白水解酶活性：操作同胆盐水解酶活性，使用1 %脱脂乳粉琼脂培养基进行测定。

1.3.4 抑菌活性

使用牛津杯法测定植物乳杆菌的抑菌活性。将指示菌大肠杆菌和单增李斯特菌活化三代后，按5 ‰接种指示菌发酵液至无菌营养琼脂培养基中混匀，倾注至平板中待其凝固后放置牛津杯，将植物乳杆菌发酵液200μL加至牛津杯中，4℃静置4 h后转到37℃条件下培养24 h，量取抑菌圈直径。

1.3.5 体外安全性评价

溶血性：使用血平板进行试验，操作同1.3.3，以金黄色葡萄球菌为阳性对照。

抗生素敏感性：将植物乳杆菌发酵液以5 ‰接种至无菌MRS琼脂培养基中混匀后倾注平板，待凝后将20种抗生素药敏试纸贴于平板上，37℃培养2 d后测定其抑制圈直径。

1.3.6 自聚集及共聚集能力

自聚集[9]：将1 mL菌悬液用旋涡混合仪涡旋10 s，在37℃下孵育5 h，轻取200μL上层悬液，测量其600 nm处的吸光值（以鼠李糖乳杆菌GG为阳性对照）。其自聚集公式如下：

式中：A1为处理5 h的吸光值；A0为初始菌悬液的吸光值。

共聚集：以单增李斯特菌和大肠杆菌对植物乳杆菌的共聚集能力进行评价。将等体积的植物乳杆菌和致病菌菌悬液混合，涡旋振荡10 s，在37℃下孵育5 h后，轻取200μL上层悬液，测量600 nm处的吸光值（A混）。其共聚集公式如下：

式中：A2和A3分别为受试菌与致病菌菌悬液单独处理5 h的吸光值。

1.3.7 疏水性

以谢璐娜[10]的方法稍作修改，将等体积的植物乳杆菌菌悬液及有机溶剂涡旋振荡2 min，37℃静置30 min后取水相测其吸光度。有机相选用二甲苯，正十六烷和乙酸乙酯（以鼠李糖乳杆菌GG为阳性对照）。

1.3.8 对Caco-2细胞的黏附能力

细胞培养：将冻存的细胞快速解冻后转入细胞瓶中，使用含10 %胎牛血清的DMEM培养基，于5%CO2、37℃条件下培养，每2 d换液，待细胞融合度高于85 %进行传代，传代5次后进行试验。

黏附试验[11]：将细胞转至6孔板中进行培养，待细胞长至单层，将培养液吸出，无菌PBS洗涤细胞两次后，加入1 mL用DMEM培养基重悬的植物乳杆菌菌悬液（菌体浓度约为1×109mL-1），5% CO2、37℃条件下孵育2 h。用无菌PBS轻轻洗涤3次以除去未黏附的细菌，再用细胞刮板收集孔中内容物。通过血球计数板确定细胞数，附着的细菌数用平板计数法测定。菌株的黏附能力计算公式如下：

1.4 数据统计

所有试验均重复三次，采用Excel 2010软件进行数据统计分析；以SPSS Statistics 26进行方差分析（ANOVA）分析；使用Origin 2018软件绘制结果图。

2 结果与讨论

2.1 耐受模拟胃肠液能力

7株植物乳杆菌耐受模拟胃肠液的能力如图1所示。人的肠胃道环境十分复杂，益生菌在胃肠道中存活的能力，将决定其能否在人体内正常发挥益生作用[12]。本次试验通过人工配置胃液及肠液对7株植物乳杆菌进行处理，37℃孵育，模拟益生菌进入人体后在肠胃中所处的消化环境，以评估其生存能力。从图1可以看出，7株植物乳杆菌在模拟胃肠液中的存活率均高于75 %，D05、D18在胃液中存活率可接近100 %；D22、D24、D26在肠液中存活率高于95%；其中，D24在胃肠液中存活表现最为突出，与阳性对照LGG相当。进入人体的乳酸菌克服了胃肠中的恶劣环境，才能够进一步在肠道中定植，以发挥其效用。

图1 植物乳杆菌对模拟胃肠液的耐受性

2.2 抑菌活性

本次试验选用革兰氏阳性菌单增李斯特菌和阴性菌大肠杆菌来测定这7株植物乳杆菌的抑菌活性，由图2可知，这7株菌对两种致病菌均有一定的抑制能力，其中，D04和D24的抑制能力较为优秀，D04对大肠杆菌和单增李斯特菌的抑制圈均高于17.5 mm，D24对单增李斯特菌的抑制圈达到22 mm。益生菌的抑菌能力，能一定程度上帮助宿主在其肠胃道中抵御有害致病菌的侵袭，且应用于食品中时，能够抑制食品中腐败菌的生长，则有助于延长商品货架期[13]。

图2 7株植物乳杆菌的抑菌活性

2.3 胆盐水解酶活性及蛋白水解酶活性

益生菌具有胆盐水解酶活性有助于增强菌株对胆盐的耐受性，延长菌体在肠胃道的滞留时间，改变宿主的消化功能或降低血清中胆固醇水平[14-15]。而具有蛋白水解酶活性的益生菌能分解外界蛋白质加以利用，也可以分泌蛋白酶帮助宿主消化[16]。由结果得知，7株菌都具备一定的胆盐水解酶活性和蛋白水解酶活性，D04、D12的实验现象更为明显，水解能力更佳，可进一步确定其酶活，作为潜在降胆固醇益生菌株继续探究。

表1 7株植物乳杆菌的胆盐水解酶活性及蛋白水解酶活性

2.4 体外安全性评价

乳酸菌可能会存在某些潜在的安全性问题，《食品中益生菌评估指南》中建议，测定益生菌菌株安全性需确定菌株耐药性和溶血性[5]。使用血平板测定这7株植物乳杆菌的溶血性结果显示，7株菌均未出现溶血现象；使用抗生素药敏片对其耐药性进行测定，发现D04对20种抗生素均有一定的敏感性，但其他6株植物乳杆菌对不同的抗生素具有一定的耐药性，如苯唑西林，D12、D24和D26对其不敏感，氨基糖苷类如卡那霉素、新霉素、庆大霉素，D05和D22对其均不敏感。这些结果与之前报道的一些乳酸杆菌耐药研究相一致[17-18]。

表2 7株植物乳杆菌的溶血性

2.5 自聚集及共聚集能力

由图3所示，7株植物乳杆菌的聚集能力差异较大。其中D05和D22的自聚集与共聚集能力都强于阳性对照LGG；D12的自聚集能力最强，但与病原菌共聚集的能力不突出，特别是与单增李斯特菌的共聚集能力只有10 %；除D18，其他植物乳杆菌的自聚集能力均高于致病菌，这与一些文献报道益生菌的自聚性高于致病菌的结果相一致[19-20]。在与病原菌单增李斯特菌和大肠杆菌的共聚集能力结果中，D22的效果最为明显，均超过90%。有研究表明，乳酸菌的自聚集能力与其在体内的黏附能力相关[21]，而乳酸菌与致病菌间的共聚集能力可能与之和致病菌竞争黏附肠上皮细胞有密切关系[22]。

表3 7株植物乳杆菌的抗生素敏感性

图3 7株植物乳杆菌的聚集能力

2.6 疏水性

图4 所示7株植物乳杆菌及LGG的疏水性结果。除D05和D12外，其他5株菌的疏水率均高于LGG，尤其D04对3种有机试剂的疏水率均超过70 %，且对乙酸乙酯表现出7株菌中最佳的疏水性；D24对二甲苯和十六烷的疏水率均高于82 %，在二甲苯中表现为最佳，十六烷中略低于D18的84 %；D05和D12疏水性都很低，但其自聚集能力都较高。一些研究人员对乳酸菌与小鼠肠黏液的黏附能力及对应的菌株的表面疏水性进行了分析，发现菌株的黏附能力与疏水性之间不存在明显相关性，故而菌株表面疏水性的高低并不能完全代表菌株黏附能力的强弱[23-24]。

图4 7株植物乳杆菌的疏水性

2.7 对Caco-2细胞的黏附能力

益生菌对肠道上皮细胞的黏附，是发挥其益生作用的先决条件，但直接在体内研究黏附能力难度较大，故而选用类似于人小肠上皮细胞的Caco-2细胞来评估益生菌的黏附能力。7株植物乳杆菌的黏附能力如图5所示，7株菌的黏附能力差异较大，D12的黏附能力最为突出，平均每个Caco-2细胞能黏附超过58个乳酸菌，D05、D22、D24、D26高于20 CFU/cell，黏附能力较好。病原菌黏附于肠道黏膜被认为是其致病的第一步[25-26]，益生菌在宿主肠道中定植后，将在肠黏膜层形成生物膜或占据黏附位点，阻止病原菌对宿主肠黏膜受体的结合，甚至清除病原菌[11]。

图5 7株植物乳杆菌的黏附能力

3 结论

本文通过对7株不同来源植物乳杆菌的益生特性进行探究，确定其在模拟胃肠液中耐受存活率均高于75%；均具有胆盐水解酶及蛋白水解酶活性；对大肠杆菌和单增李斯特菌具有一定抑制能力；无溶血性且对大部分抗生素敏感；其中，D12具有最强的自聚集能力及最佳黏附能力；而D05和D22的聚集能力表现较佳，D04和D18的疏水能力更强。因此，这7株植物乳杆菌可作为潜在益生菌菌株应用于食品中，但7株菌的益生特性各有侧重，需要进一步对其优势方面进行探究，运用于不同食品中以发挥其最大效用。