低聚乳果糖对益生性植物乳杆菌冰淇淋加工特性的影响

马依淼，刘少莉，郑义，陈超，曹永强，杨贞耐,

（1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京市食品添加剂工程技术研究中心 北京工商大学,北京100048;2.东君乳业（禹城）有限公司，山东德州253000）

0 引言

低聚糖，又名寡糖(Oligosaccharides)，是指单糖聚合度介于2～10之间的一类复合碳水化合物的总称。低聚乳果糖是由葡萄糖、半乳糖和果糖组成的一种功能性低聚糖[1]；是双歧杆菌的有效增殖因子[2]；双歧杆菌的增殖有利于短链脂肪酸如乳酸、丁酸、戊酸的生成，可降低肠道pH并抑制致病菌的繁殖[3]。日本在2005年就将低聚乳果糖列入特定健康用途食品[4]；低聚乳果糖作为具有益生元特性的低热量碳水化合物，可直接添加在食品体系中代替普通糖料，在提供产品甜味的同时，发挥重要的生理功能[5]，如预防龋齿、降低血液中的胆固醇、改善血脂、促进钙吸收等[6-7]。

近年来，益生菌食品的研发和应用成为热点。相对于其他益生菌制品而言,冰淇淋的冷冻储存条件和适宜的pH值有助于其中益生菌的稳定和存活[8]。研究发现低聚果糖、低聚木糖以及菊粉等低聚糖可有效促进有益菌的生长并维持其在各种食物载体中的活力[9]。低聚糖在益生菌食品加工贮藏过程中对益生菌具有保护作用[10-11]；而且低聚糖与益生菌配伍使用可以提高益生菌的益生效果[12]。但是，低聚乳果糖作为一种益生元却很少被研究其对益生菌的保护和促生长作用；低聚乳果糖对益生菌冰淇淋微生物及理化指标的影响研究较少。将功能性低聚糖与益生菌结合应用于冰淇淋加工，既能提升冰淇淋的营养价值及独特风味，又可以强化低聚糖的益生元功能，非常适合现代人群的消费需求。

植物乳杆菌YW11是从西藏灵菇分离筛选得到的具有良好益生特性的菌株[13]。本研究探讨了不同添加量的低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11生长、产酸和抑制病原菌效果的影响，并将此菌株应用于益生菌冰淇淋加工，研究不同添加量低聚乳果糖对冰淇淋浆料黏力、产品硬度、膨胀率、融化率、益生菌存活率及胃肠道耐受性的影响，获得高活性益生菌发酵型冰淇淋，为低聚乳果糖及益生植物乳杆菌的配伍应用于冰淇淋加工提供科学依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

植物乳杆菌YW11(NCBI检索号：KM265361)分离于西藏灵菇样品，本课题组实验室保藏；大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，李斯特菌，志贺氏菌，沙门氏菌，阪崎肠杆菌等菌株保藏于本实验室；低聚乳果糖（分析纯），山东澳邦生物科技有限公司。

MRS液体培养基：葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，柠檬酸钠5.0 g/L，无水乙酸钠5.0 g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L、硫酸锰0.05 g/L、吐温80 1 mL/L、蒸馏水1 000 mL，pH值为6.6，121℃灭菌15 min。MRS固体培养基是在MRS液体培养基的基础上添加15 g/L的琼脂粉。

LB液体培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH值为7.0，121℃灭菌15 min。LB固体培养基是在LB液体培养基的基础上添加15 g/L的琼脂粉。

1.2 仪器与设备

PL203型电子天平，梅特利-托利多（上海）仪器有限公司；低温冰箱（-80℃），美国Thermo公司；MLS-3750高压蒸汽灭菌器，日本三洋公司；S20型数显pH计，上海Mettler公司；Elx800型酶标仪，美国博腾仪器有限公司；恒温培养箱，上海一恒仪器科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株活化

植物乳杆菌YW11保存在含50%甘油的MRS培养基中，-80℃冻存。将冻存菌接种于MRS液体培养基，37℃连续活化2代后用于进一步实验。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、志贺氏菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌均保存在含50%甘油的LB培养基中，-80℃冻存。将冻存菌接种于LB液体培养基，37℃连续活化2代后用于进一步实验。

1.3.2 低聚乳果糖对YW11增殖影响实验

以添加0.1 %、0.2 %、0.4 %、2.0%低聚乳果糖的MRS液体培养基为实验处理组（2.0%为低聚乳果糖完全取代培养基中葡萄糖作为碳源的添加量），正常的MRS培养基为对照组。采用测量吸光度和平板计数法考察不同浓度低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11增殖的影响。活化2代之后的YW11按3%的量分别接种到上述MRS培养基中，37℃、200 r/min条件下培养。在培养0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、48、52、60 h时取样，使用酶标仪测定OD600 nm值。每个处理设3次重复，取平均值绘制生长曲线。

此外，将活化后的菌悬液，按10倍梯度稀释法稀释，选择合适的稀释度，均匀涂布于预先倾注好的MRS固体培养基。37℃恒温条件下倒置培养48 h。取出各培养皿，观察菌落生长情况，分别计数各稀释度平板表面生长的菌落数，以菌落数50～300的平板为统计对象，计算植物乳杆菌YW11增殖的菌落数(lg CFU/mL)，每个处理设3次重复。

1.3.3 低聚乳果糖对YW11产酸（pH）的影响

以添加0.1 %、0.2 %、0.4 %、2.0%低聚乳果糖的MRS液体培养基为实验处理组，正常的MRS培养基为对照组。活化两代之后的YW11按3%的量分别接种到上述培养基中，置于37℃恒温水浴锅，利用乳品发酵监控仪每30 s测定一次pH，连续测定24 h并绘制pH值变化曲线。

1.3.4 低聚乳果糖对YW11抑菌作用的影响

以添加0.1 %、0.2 %、0.4 %、2.0%低聚乳果糖的MRS液体培养基为实验处理组，正常的MRS培养基为对照组。采用牛津杯法考察不同浓度低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11增殖的影响。将活化后的YW11以3%接种量接种于上述培养基中，37℃、200 r/min条件下培养。活化2代之后的6种致病菌按3%的量分别接种到LB固体培养基中，混匀后倒入培养皿，待其冷却凝固后，将灭过菌的牛津杯平稳地放在培养皿上，保证各牛津杯之间距离适当。在牛津杯中分别加0.1 mL植物乳杆菌YW11原菌液和发酵产物即离心后的上清液，培养皿平放于37℃恒温培养箱中培养8 h后观察抑菌效果，并测量抑菌圈直径大小。每个处理设3次重复。

1.3.5 益生菌冰淇淋的工艺流程

配料（鲜牛乳、全脂乳粉、麦芽糖浆、双乙酰酒石酸脂肪酸酯、海藻酸丙二醇脂肪酸酯）→分散均质（15 MPa，2 min）→巴氏杀菌→老化（温度降至40℃）→接种发酵(添加植物乳杆菌YW11)→添加砂糖、羧甲基纤维素钠、果胶、瓜尔豆胶→均质（20 MPa，2 min）→凝冻（冰淇淋机，25 min）→硬化（-20℃）。

在冰淇淋的基础配方中低聚乳果糖，以添加

0.1 %、0.2 %、0.4 %、2.0%低聚乳果糖的MRS液体培养基为实验处理组，未添加低聚乳果糖为对照组。

1.3.6 冰淇淋活菌数的测定

采用平板涂布计数法测定冰淇淋贮藏期间的活菌数。取冰淇淋样品并对其进行梯度稀释，取适宜倍数的0.1 mL稀释液涂布于MRS固体培养基上，在37℃条件下倒置培养48 h。记录各组冰淇淋样品-20℃贮存1～30 d的活菌数变化。每个处理设3次重复。

1.3.7 冰淇淋中植物乳杆菌YW11模拟胃肠道耐受性实验

同一天取-20℃贮存的冰淇淋样品，测定植物乳杆菌YW11在体外模拟胃、肠道环境下的存活能力。测定方法参照邹婷婷[14]的方法，略作改动。

取冰淇淋样品25 g，使用22 mL 0.05 g/L NaCl溶液稀释后混合均匀制成样品溶液。

模拟胃液环境：蒸馈水稀释稀盐酸，调节pH为3.0，每100 mL液体中加1 g胃蛋白酪，充分溶解后，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后待用。样品溶液以2%（体积分数）的接种量接种到上述人工胃液中，充分混匀后放置于37℃培养2 h。平板计数法测定活菌数并计算存活率。每个处理设3次重复。

模拟肠液环境：取KH2PO46.8 g，加蒸馏水500 mL溶解，用质量浓度为4 g/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加水稀释至1 L，迅速加入牛胆盐3 g，胰蛋白酶10 g，充分溶解后，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后待用。样品溶液以2%（体积分数）的接种量接种到上述人工胃液中，充分混匀后置于37℃培养2 h。平板计数法测定活菌数并计算存活率。每个处理设3次重复。

1.3.8 冰淇淋浆料粘力的测定

采用质构仪测定老化后的冰淇淋浆料黏力。参考赵雯等[15]的方法，略作改动。将-20℃冷冻的冰淇淋样品于4℃缓慢解冻，用玻璃棒将冰淇淋样品轻轻搅拌均匀(顺时针和逆时针各搅拌10圈)，选用TA10探头，测定速度为0.5 mm/s，刺入深度1 cm。每个处理设3次重复。

1.3.9 冰淇淋产品理化指标测定

硬度的测定：采用质构仪测定冰淇淋于-20℃贮存48 h时的硬度。选用TA10探头，测定速度0.5 mm/s，刺入深度1 cm。每个处理设3次重复。

膨胀率的测定：采用体积计算法，根据称量的同重量混合原料的体积与同重量冰淇淋的体积，按照下式计算膨胀率。每个处理设3次重复。

膨胀率(%)=(IV-MV/MV）×100%

式中：IV为同重量下冰淇淋的容积，（L）；MV为同重量下混合原料的容积，（L）；融化率的测定：称取25 g于-20℃贮存30 d的冰淇淋成品，置于不锈钢筛网上，网下放置一个烧杯，在室温环境下静置，每隔5 min称其融化质量，每个处理设3次重复。抗融化性以融化率表示，融化率越低，说明抗融化性越好。按照下式计算融化率：

融化率(g/min)=融化的冰淇淋质量之差/时间差

1.4 数据分析

使用Excel进行数据统计，图表在Origin 2018中生成，所有组别数据均为3次重复实验测定后取平均值，结果用“平均值±方差”表示。

2 结果与分析

2.1 低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11生长特性的影响

添加不同浓度低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11生长的影响不同，培养过程中培养基的OD600nm和活菌数变化曲线见图1a和图1b。随着YW11菌株的增殖，菌体浓度升高导致发酵液吸光度增加。各组在0～4 h内处于延迟期，生长缓慢；4～12 h为迅速增殖的对数生长期；之后进入稳定期，生长逐渐减缓，吸光度趋于稳定。24 h后菌体进入衰亡期，吸光度也略有下降。

图1 不同添加量的低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11生长的影响

与对照组的基础培养基相比，添加0.1%、0.2%、0.4%的低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11均有一定的增殖作用，但低聚乳果糖完全替代培养基中的葡萄糖作为碳源时，YW11的活菌数明显下降，表明低聚乳果糖不能有效地被菌株利用，为其生长提供足够的能量。生长稳定期各实验组的吸光度均高于空白对照组，但是，稳定期的吸光度并没有随着低聚乳果糖添加量的增加而增加，添加0.2%的低聚乳果糖时吸光度略高，菌体浓度最高达到10.77 lg CFU/mL。说明适当添加低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11的增殖有较好的促进作用。

2.2 低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11产酸的影响

非消化性低聚糖是膳食益生元，它们通过选择性促进肠道内有益菌增殖，产生短链脂肪酸，降低肠道pH环境或作为肠道细胞的营养物质，对宿主产生有益影响[16]。乳杆菌能够酵解碳水化合物产生乳酸，帮助人体消化吸收，降低肠道内环境的pH，阻止有害菌在肠道上皮的黏附作用，刺激免疫球蛋白的产生，调节宿主免疫力[17]。

为了进一步研究低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11产酸的影响，对YW11发酵过程中的pH变化进行监测（见图2）。结果表明，发酵过程中YW11菌株产酸能力较好，pH值呈逐渐下降的趋势。在发酵开始至约300 min，培养基营养丰富的情况下，低聚乳果糖的添加对植物乳杆菌YW11的pH值下降速率无明显影响。在发酵末期（1 200 min后），随着低聚乳果糖添加量增加至0.4%，植物乳杆菌YW11进一步产酸使发酵液pH值继续下降至最低值3.65。当低聚乳果糖全替代葡萄糖作为碳源培养时，pH值下降速率明显变慢且最终体系的pH值较高，表明其产酸能力受到了较大影响，与上述菌株生长受到抑制的结果一致。植物乳杆菌的大量繁殖和pH的快速下降能保证发酵体系不被杂菌所污染，从而创造一个合适的生长环境[18]。

图2 不同添加量的低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11生长过程中pH值变化的影响

2.3 低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11抑制病原菌作用的影响

植物乳杆菌可以分泌细菌素等抗菌物质，从而体现一定抑菌特性[19]。植物乳杆菌是兼性乳酸发酵菌，进行同型乳酸发酵或异型乳酸发酵，这两种代谢进行程度和比例取决于菌种性质和外界培养条件，从而影响其抑菌特性[12]。对比植物乳杆菌YW11在不同浓度低聚乳果糖作用下对大肠杆菌等6种常见致病菌抑菌活性的影响，结果如图3所示。抑菌圈直径越大，表示菌体的抑菌效果越好。植物乳杆菌YW11对这6种致病菌均有不同程度的抑制作用，抑菌圈直径在0.90～1.55 cm之间。相比于基础培养基，低聚乳果糖的适量添加能够明显提高植物乳杆菌YW11的抑菌能力，但仅有低聚乳果糖作为植物乳杆菌YW11的生长碳源时，对其抑菌特性没有明显影响。不同致病菌的最佳抑菌效果所需的低聚乳果糖添加量也有所不同，对于大肠杆菌、志贺氏菌和阪崎肠杆菌抑菌效果最佳的低聚乳果糖添加量为0.2%，对于李斯特菌和沙门氏菌抑菌效果最佳的低聚乳果糖添加量为0.1%，而金黄色葡萄球菌抑菌效果最佳的低聚糖添加量则是0.4%。

图3 不同添加量的低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11抑制病原菌作用的影响

2.4 低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11冰淇淋加工特性的影响

2.4.1 低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11冰淇淋理化特性的影响

冰淇淋配料种类丰富，可以为益生菌提供充足的营养物质如乳蛋白、乳脂肪、乳糖、维生素等，并且具有较为温和的pH值环境，因此被认为是良好的益生菌传递载体[20]。添加一定量的低聚乳果糖一方面促进冰淇淋中益生菌的增殖，另一方面对冰淇淋的理化性质也有一定影响。表1显示添加低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11发酵冰淇淋的浆料黏力、硬度、膨胀率、融化率的影响。

提高冰淇淋浆料的黏力有利于降低冰淇淋浆料的水分活度，从而降低其中水的结冰温度，提高冰淇淋的细腻滑润口感，并能有效提高冰淇淋的抗融性[21]。在YW11发酵的冰淇淋中添加不同量的低聚乳果糖，研究冰淇淋浆料及成品的质构变化。由表1可知，冰淇淋浆料的黏力随着低聚乳果糖的添加量的增加而增大。有研究表明益生元能促进浆料中益生菌的生长并产生胞外多糖，进而增加低脂冰淇淋浆料的黏度[22]。

冰淇淋的硬度随低聚乳果糖添加量的增加而降低，但是全替代葡萄糖组即添加量为2.0%时，样品硬度最小（见表1）。添加量为0.1%时硬度较大，咀嚼性较强，说明此时对变形的抵抗能力最大。这可能是由于冰淇淋含水量较高，冰结晶体积较大所造成的[23]。有研究表明冰淇淋硬度的变化与可溶性固形物含量增加引起冰点的变化有关，硬度太大会影响产品的膨胀率和感官评分[24]。

随着低聚乳果糖添加量的增加，冰淇淋膨胀率呈现先上升后下降的趋势，添加量为0.1%时膨胀率最低，添加量为0.2%时膨胀率最高，（见表1）。可能是因为黏度的增加对气泡有很好的吸附和稳定性作用，然而当冰淇淋系统太黏稠，会阻止剧烈的搅动和空气进入，使膨胀率降低[25]。

融化率是冰淇淋的重要属性，影响其感官品质[26]。质量好的冰淇淋要求其有一定的抗融性，保障其在未被完全食用完之前不至于全部融化[27]。由表1可知，各实验组冰淇淋的融化率均低于对照组，低聚乳果糖添加量为0.4%时抗融性最好。表明增加浆料黏力可以延缓融化速率。有研究表明，冰淇淋在热传导下内部冰晶融化后，水分流入冰淇淋内部使冰淇淋料液被稀释，当稀释到一定程度后液体滴下，因此融化率与冰淇淋浆液的黏度相关[28]。一般而言，黏度越大，融化率越低[29]。

表1 不同添加量低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11冰淇淋理化特性的影响

2.4.2 冰淇淋冷冻贮藏期间益生菌的存活及其模拟胃肠道耐受能力的变化

益生菌在发挥其润肠通便等肠道调节功能时，相比其他药物具有安全、无副作用等明显优势[30]，把益生菌与功能性低聚糖相结合应用于冰淇淋加工是营养与保健的有效结合[31]。而发酵冰淇淋在冷冻储藏过程中，随着储藏时间的延长其活菌数随之变化，因此保证其货架期内的生物活性至关重要。利用YW11发酵制作冰淇淋，并添加不同浓度的低聚乳果糖，在冰淇淋储藏期间活菌数的变化如图4所示。冰淇淋中的活菌数随储藏时间的延长呈现逐渐下降的趋势。添加低聚乳果糖后活菌数均高于对照组，可能是其对菌株具有一定保护作用。添加量为0.2%时最终活菌数最多，为5.94 lg CFU/mL。

图4 植物乳杆菌YW11发酵冰淇淋于-20℃贮存30 d过程中的活菌数变化

乳酸菌对胃肠道环境是否具有耐受性、能否顺利到达肠道是其发挥益生功能的前提条件[32]。胃酸对乳酸菌具有明显的酸胁迫作用，其耐胃酸能力直接决定着乳酸菌在胃肠道最终的存活率和功效的发挥，故耐人工胃液能力是评价乳酸菌益生特性的关键指标之一[33]。胃液主要由黏液、盐酸、胃蛋白酶组成，在胃液作用下，微生物的活菌数会逐渐减少[34]。由图5可知，经人工模拟胃液处理2 h后，YW11菌株存活率均在60%以上，添加0.2%低聚乳果糖的菌株存活率最高，为81.77%。表明在冰淇淋冷冻贮藏过程中低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11具有一定的保护作用，可提高其在胃肠环境中的存活率。

图5 植物乳杆菌YW11在人工模拟胃液中的存活率

肠液主要成分为胰液和胆汁。胰液中的胰蛋白酶可水解微生物的菌体蛋白质，抑制乃至杀死微生物。胆汁中含有一定量胆盐，能改变微生物细胞膜的通透性，抑制、杀死进入肠道的微生物[14]。菌株在整个胃肠道历程中必须稳定，能够不被胃酸降解并可耐受胆汁[35]。因此需评估菌株对肠液的耐受能力。由图6可知，经过2 h模拟肠道消化后，与空白对照组相比，添加了低聚乳果糖的植物乳杆菌YW11能保持较高的存活率，均在70%以上。添加量为0.4%时，菌株耐受模拟肠液能力最强，存活率为83.72%。表明植物乳杆菌YW11可耐受人工肠液，且添加低聚乳果糖可以提高菌株的模拟胃肠液耐受能力。Rajam等[11]研究也表明低聚糖能很好地改善植物乳杆菌的生存能力并使益生菌具有较好的耐酸耐胆盐能力。

图6 植物乳杆菌YW11在人工模拟肠液中的存活率

3 结论

本研究考察了低聚乳果糖对益生性植物乳杆菌YW11增殖和产酸能力，及其发酵冰淇淋加工特性的影响。结果表明，低聚乳果糖可以促进植物乳杆菌YW11的生长，培养基中添加0.2%的低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11生长的促进作用最佳，活菌数达10.77 lg CFU/mL；添加0.4%的低聚乳果糖可以促进YW11在发酵末期进一步产酸至pH下降至最低值3.65；低聚乳果糖可以不同程度地增强植物乳杆菌YW11对常见致病菌的抑制作用。利用植物乳杆菌YW11制作发酵冰淇淋，随着低聚乳果糖添加量的增加，冰淇淋浆料的黏力增大，产品硬度降低；低聚乳果糖添加量为0.2%时冰淇淋膨胀率最高，添加量为0.4%时抗融性最佳；冰淇淋冷冻贮藏期间活菌数逐渐下降，添加低聚乳果糖可提高YW11在冰淇淋冷冻贮藏期间的存活率，改善其对胃肠道环境的耐受性。

国内对低聚乳果糖的研究尚未深入，本实验通过研究低聚乳果糖对植物乳杆菌YW11益生特性的影响，发现了其潜在的益生元功能，为其食品加工新途径提供了理论依据。研发健康新颖的产品是食品行业的发展趋势，本实验也为提高益生菌冰淇淋中菌株存活率提供了一种技术方法。将低聚乳果糖与植物乳杆菌YW11配伍应用于冰淇淋中，产品既能满足大众对食品品质的要求，同时有利于人体健康，符合当代消费需要，应用前景非常广阔。