薇菜酸性多糖的分离纯化及成分分析

胡彦波，刘 扬，赵偲如，赵 珺

(长春大学食品科学与工程学院，长春 130022)

薇菜(Osmundajaponica)属紫萁科紫萁属分株紫萁，学名桂皮紫萁，是长白山地区野生山野菜之一，富含多糖、蛋白质和微量元素等，具有提高免疫力、抗菌和抗病毒等功效[1-2]。因其独特的生物活性，目前薇菜被誉为“山菜之王”[3]。薇菜多糖是一种具有复杂结构的大分子化合物[4]，研究表明，薇菜多糖具有抗氧化、抗肿瘤和抑菌等多种功能，此外，薇菜多糖对机体的生长发育和代谢起着重要的作用[5-7]。由于薇菜多糖以水溶性多糖为主，目前关于薇菜多糖的提取方法多采用水提醇沉法，还有微波辅助提取法和超声波辅助提取法等辅助提取技术[8-10]。虽然微波辅助提取法和超声波辅助提取法可在一定程度上增加薇菜多糖得率，但对薇菜多糖的精细结构是否存在影响尚未进行深入研究。此外，部分科研人员对薇菜进行了初步的分离纯化。例如，李磊等[11]采用离子交换柱层析法对薇菜多糖进行分离纯化，结果发现薇菜多糖主要以酸性多糖为主。柯琼华等[12]利用Sevage法和Sephadex G-200柱层析法对薇菜多糖进行分离纯化，进一步通过红外光谱和高效液相色谱(HPLC)分析，得到薇菜多糖的单糖组成为木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和鼠李糖以及三种未知成分。由于薇菜多糖的分离纯化技术和结构分析程度有限，针对薇菜多糖的生物活性研究极少[13]。目前，薇菜作为大宗山野菜，远销日本和韩国等多个国家，但由于缺乏对薇菜多糖系统的分离纯化和结构分析，其深入研究尚未进行，限制了薇菜的开发与应用。因此，通过对薇菜多糖进行系统的分离纯化，并对其纯化后的组分进行分析和鉴定，为薇菜多糖的深入研究及相关功能性食品的开发提供了参考依据，并推动了长白山地区野生资源的精深加工。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料：薇菜，购于吉林省长白山露水河镇林区。

供试试剂：苯酚、硫酸(分析纯)，北京化工厂有限责任公司；Sepharose CL-6B，上海索宝生物科技有限公司；乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)，美国天地TEDIA；KBr(分析纯)，北京索莱宝科技有限公司；NaCl(色谱纯)，上海麦克林生化科技有限公司；TFA(sigma标准品)、DEAE-纤维素柱，上海源叶生物科技有限公司。

供试仪器：BM312-B旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；3K15台式高速离心机，上海亚荣生化仪器厂；LC-10AT高效液相色谱仪，日本岛津公司；Nicolet is 5傅里叶红外光谱仪，赛默飞世尔科技公司；RID-10A示差检测器，日本岛津公司；TSK-gel G-3000 PWXL色谱柱，赛默飞世尔科技公司。

1.2 试验方法

1.2.1 薇菜酸性多糖制备 采用水提醇沉法提取薇菜总多糖。称取新鲜薇菜4 kg，切成1 cm小段，在料液比为1∶20 g·mL-1、提取时间为4 h的条件下提取薇菜总多糖。用旋转蒸发仪将薇菜总多糖溶液浓缩至原体积的1/3，70%乙醇过夜醇沉后4 000 rpm·min-1离心20 min弃去上清液得到沉淀，即为薇菜总多糖WOJP。进一步在60 ℃水浴下搅拌烘干，除去乙醇，加蒸馏水溶解，冷冻干燥。然后用DEAE-纤维素对WOJP分离纯化，蒸馏水洗脱制备薇菜中性多糖WOJP-N，0.2 mol·L-1NaCl溶液洗脱制备薇菜酸性多糖WOJP-A。

1.2.2 薇菜酸性多糖的分离纯化 称取WOJP-A 100 mg，溶于2 mL的蒸馏水中，离心去除沉淀，将上清液上样于平衡好的Sepharose CL-6B凝胶色谱柱，0.15 mol·L-1NaCl洗脱液，流速0.15 mL·min-1，每管收集液体体积3 mL。利用苯酚-硫酸法[14]于490 nm处测定收集液的吸光度，绘制洗脱曲线，根据WOJP-A的洗脱曲线，收集合适的洗脱峰，透析浓缩冻干，获得分子量均一组分。WOJP提取和分离纯化的技术路线如图1所示。根据薇菜多糖的电荷和分子量的不同可选择不同的分离纯化方式。使用DEAE-纤维素柱层析经过0.2 mol·L-1NaCl洗脱获得电荷均一组分的WOJP-A，进一步使用Sepharose CL-6B分离纯化获得分子量不同的四个多糖组分。

1.2.3 薇菜酸性多糖的分子量分布测定 称取1 mg薇菜酸性多糖的不同组分样品，溶解于200 μL超纯水(ddH2O)中，采用高效液相系统，RID-10A示差检测器及TSK-gel G-3000 PWXL色谱柱对分离纯化的多糖分子量分布均一性测定，流速0.6 mL·min-1，流动相为0.2 mol·L-1NaCl水溶液，柱温35 ℃检测[15]。

1.2.4 薇菜酸性多糖的单糖组成测定 称取1 mg薇菜酸性多糖待测样品置于酸水解小瓶中，加入1 mL 2 mol·L-1盐酸甲醇溶液，充N2密封，置于80 ℃金属浴中水解10 h后空气泵吹干，再加入1 mL 2 mol·L-1三氟乙酸(TFA)，置于金属浴中120 ℃水解1 h，用空气泵吹干除去TFA。分别取浓度为1 mg·mL-1的甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GlcA)、鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)和岩藻糖(Fuc)9种单糖标准品溶液各100 μL混合，置于酸水解小瓶中吹干。然后将待测样品和标准品进行PMP柱前衍生化和HPLC检测分析单糖组成[16-17]。

1.2.5 薇菜酸性多糖的红外光谱分析 取充分干燥的薇菜酸性多糖粉末样品1 mg，与180 mg溴化钾(KBr)一起研磨后制成透明压片，使用傅里叶红外光谱仪于4 000～500 cm-1波长范围内进行红外光谱扫描分析，得到红外光谱曲线。

1.3 数据分析

采用Origin 8.5软件处理试验数据。

2 结果及分析

2.1 薇菜酸性多糖的分离纯化

采用烘干的方式测定薇菜含水量为92.4%，即薇菜干物质质量为7.6%。将薇菜按照干物质质量和蒸馏水比例为1∶20 g·mL-1进行热水煮提，进一步采用70%乙醇醇沉制备薇菜总多糖WOJP。提取后根据是否带电荷利用DEAE-纤维素柱层析将WOJP分离纯化，制备不含电荷的中性多糖WOJP-N和带电荷的酸性多糖WOJP-A。根据WOJP-A分子量分布不同，利用Sepharose CL-6B对WOJP-A分离纯化。利用苯酚-硫酸测定洗脱液的吸光值，绘制洗脱曲线如图2所示，经过Sepharose CL-6B分离纯化后，WOJP-A分成4个组分。分别将4个多糖组分浓缩、透析和冻干，进一步称量质量，其中WOJP-A-b和WOJP-A-c为主要组分，其得率分别为24.6%和27.6%。

2.2 高效液相凝胶排阻色谱分析薇菜酸性多糖各组分的分子量分布

利用TSK-gel G-3000 PWXL色谱柱对分离纯化的WOJP-A-b和WOJP-A-c分子量分布情况进行测定。WOJP-A-b的色谱结果如图3所示。由图3可知，WOJP-A-b的洗脱峰呈均匀对称分布，说明其分子量相对均一，是薇菜多糖的一种均一组分。经计算，WOJP-A-b分子量的大小为10.6 kDa，说明WOJP-A-b是含有几十个单糖的均一多糖组分。

WOJP-A-c的色谱结果如图4所示。由图4可知，WOJP-A-c的洗脱峰与WOJP-A-b的形状相似，也呈均匀对称分布，说明其分子量相对均一。经计算，WOJP-A-c分子量的大小为4.5 kDa，说明WOJP-A-c是含有10～20个单糖组成的均一寡糖组分。

2.3 高效液相色谱法分析薇菜酸性多糖的单糖组成

进一步通过高效液相色谱法测定WOJP-A以及分离纯化后的均一组分WOJP-A-b和WOJP-A-c的单糖组成。经过计算各组分的单糖摩尔比，如表1所示。由表1可知，三种多糖均含有Rha、GalA、Gal和Ara四种单糖，此外还含有少量Glc和Xyl。但三者在单糖含量上存在很大差异。WOJP-A主要单糖的摩尔比为Rha∶GalA∶Gal∶Ara=7.0∶56.4∶26.1∶5.2；分离纯化后的WOJP-A-b主要单糖的摩尔比为Rha∶GalA∶Gal∶Ara=3.7∶68.3∶12.5∶9.0；WOJP-A-c主要单糖的摩尔比为Rha∶GalA∶Gal∶Ara=6.8∶39.4∶41.2∶11.8。综上，WOJP-A和WOJP-A-b单糖组成较为相似，主要由GalA组成，推测其可能主要由半乳糖醛酸聚糖组成；WOJP-A-c则主要由Gal和GalA组成，推测其可能由部分半乳糖醛酸寡糖和半乳寡糖组成。

表1 薇菜酸性多糖各组分的单糖组成及分析

2.4 红外光谱分析薇菜酸性多糖各组分的特征官能团

利用红外光谱对分离纯后的WOJP-A-b和WOJP-A-c含有的特征官能团进行测定，并参考Feng等[18]进行分析，结果如图5～6所示。由图5～6可知，WOJP-A-b和WOJP-A-c的光谱图含有的特征吸收峰大致相同，分别为3 400 cm-1左右的-OH伸缩振动吸收峰，2 920 cm-1左右的C-H伸缩振动吸收峰，这两个吸收峰是多糖的特征吸收峰。同时，在两个多糖的光谱中可以看到1 740 cm-1和1 610 cm-1左右的特征吸收峰。分析其为C=O的伸缩振动及C=O的非对称伸缩振动吸收峰，说明这两个多糖中可能含有-COOH，是一种含有一定酯化程度的酸性多糖。但比较二者红外光谱中吸收峰的相对高度不同，说明二者含有的酸性糖以及酯化的酸性糖是不同的。此外，还可以观察到1 100 cm-1和1 020 cm-1附近的吸收峰，为酯羰基(C-O-C)伸缩振动和C-O-H连接所致，是吡喃环的特征吸收峰，说明两种多糖均含有吡喃糖环。与WOJP-A-c不同，WOJP-A-b在838.63 cm-1附近存在一个特征吸收峰，其为α-糖苷键的特征吸收峰，说明WOJP-A-b含有α-糖苷键，其结果与单糖组成分析的推测结果相吻合。

3 结 论

本研究利用Sepharose CL-6B对薇菜酸性多糖WOJP-A分离纯化，成功制备了两个均一组分WOJP-A-b(24.6%)和WOJP-A-c(27.6%)，其分子量分别为10.6 kDa和4.5 kDa。单糖组成表明，WOJP-A、WOJP-A-b和WOJP-A-c三种多糖的单糖组成相似，但含量明显不同。其中WOJP-A和WOJP-A-b主要由GalA组成，推测其可能主要由半乳糖醛酸聚糖组成；WOJP-A-c则主要由Gal和GalA组成，推测其可能由部分半乳糖醛酸寡糖和半乳寡糖组成。红外光谱分析结果表明，WOJP-A-b和WOJP-A-c含有的-OH、-CH和-COOH等多种特征吸收峰大致相同，说明二者含有多糖的特征官能团基本一致。本研究为薇菜多糖的深入研究和相关功能性食品的开发提供参考依据，并推动了长白山地区野生资源的精深加工。