依诺肝素钠注射液分子量与分子量分布比较研究

由鹏飞，薛维丽，杭宝健，李春焕，王玉团，陈晓，咸瑞卿

(山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101)

依诺肝素钠(enoxaparin sodium)属于低分子肝素类(low molecular weight heparin，LMWH)药物，具有抗血栓作用强、出血风险小的特点[1-2]，主要用于预防静脉血栓形成；治疗已形成的深静脉血栓及肺栓塞；预防血液透析体外循环时血栓的形成；与阿司匹林联用治疗不稳定性心绞痛和非Q波心梗等[3]。依诺肝素钠注射液最早由法国Aventis公司研制，是目前LMWH药物中最为畅销的品种[4-5]。依诺肝素钠注射液及原料在《英国药典》(BP2019)、《美国药典》(USP42)均有收录，《欧洲药典》(EP10.0)收录了依诺肝素钠原料，此外2017年国家药典委还公布了依诺肝素钠注射液及原料的征求意见稿。

分子量与分子量分布与抗凝活性关系密切[6]，是依诺肝素钠的重要的质控指标[7]，目前各生产企业标准均采用分子排阻色谱法测定，但所用对照品、色谱柱、流动相、检测器类型、限度要求均有所不同，不能有效评价样品的质量差异，因此我们以2019年依诺肝素钠注射液国家评价抽验为依据，在法定检验的基础上，采用原研制剂质量标准的方法对国内各生产企业的样品进行了分子量与分子量分布的测定，考察国内仿制制剂与原研制剂的差异，并将该结果与各企业质量标准方法测定结果进行了比较，为进一步统一质量标准，提高仿制药与原研制剂的一致性，加强产品质量控制提供参考。

1 仪器与试剂

Waters高效液相色谱仪(2487紫外检测器，2414示差检测器，Empower工作站)；Mettler Toledo XSE205DU电子天平；Millipore超纯水机。

水为Millipore Q-POD制备的纯化水；其他试剂均为分析纯。

依诺肝素钠注射液来自2019年国家评价性抽验，包括6家国产企业及1家原研企业(赛诺菲)的各3批样品。WHO低分子量肝素分子量测定对照品(批号：05/112)；EP低分子量肝素分子量测定对照品(批号：3.0 Mn3800)；USP低分子肝素钠分子量测定对照品A(货号：1235853，分子量为1 400、2 250、4 550、9 250 Da)、USP低分子肝素钠分子量测定对照品B(货号：1235864，分子量为1 800、3 350、6 650 Da)。

2 试验方法

2.1 法定检验方法 按各企业执行的质量标准检验，共7个标准，分别为原国家食品药品监督管理局标准YBH04982006、YBH00362015、YBH00692013、YBH00062014、YBH01132015、YBH02232016、JX20140211，其中原研制剂进口注册标准为JX20140211。各企业标准中分子量与分子量分布项下方法均有所不同，通过调研确定了各企业所用的对照品来源，方法汇总见表1。

表1 各企业分子量与分子量分布方法

2.2 原研制剂方法

2.2.1 溶液配制 对照品溶液的制备：取WHO低分子量肝素分子量测定对照品适量，加流动相溶解，制成每1 mL约含10 mg的溶液，摇匀。

供试品溶液的制备：取本品适量加流动相制成每1 mL约含1 500 IU的溶液。

2.2.2 色谱条件 色谱柱TSK G2000SWXL(7.8 mm×300 mm)；柱温35 ℃；流动相 0.1 mol·L-1醋酸铵溶液；流速：0.5 mL·min-1；进样体积25 μL；示差折光检测器。

2.2.3 测定方法 取对照品溶液25 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。准确计算对照品溶液色谱图中依诺肝素的总面积(不包括盐峰)及每个点的累积峰面积百分比，确定与依诺肝素钠分子量对照品附带的宽分布标样表中累积峰面积百分比最接近点的保留时间及对应的分子量，以保留时间为横坐标，分子量的对数值为纵坐标，使用GPC软件，拟合三次方程，建立校正曲线，相关系数应不小于0.990。

取供试品溶液25 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，数据采用GPC软件处理。

3 结果与讨论

3.1 重均分子量结果 将各企业样品采用各自质量标准方法与原研制剂方法的检测结果进行比较，发现原研制剂方法测得的重均分子量普遍高于法定检验结果，但大部分企业差异不大，偏差在2%以内，其中企业D二者结果差异显著，偏差为8%。企业D采用的是EP对照品，其数据处理方法较其他采用EP对照品的厂家不同，其他企业采用紫外检测器和示差检测器联用，用GPC软件统计保留时间与分子量的三阶曲线方程计算供试品的分子量与分子量分布，而该企业仅使用示差检测器，是以低分子量端的第一个峰分子量为600计，每增加一个峰分子量递增600，由Origin软件统计对照品分子量与保留时间的二次曲线方程，由GPC软件计算供试品的分子量与分子量分布，该方法可能带来较大的误差；将各企业样品均采用原研制剂方法进行检测，可看出不同企业样品的重均分子量有所差别，其中企业A的重均分子量最低，企业E和企业F的重均分子量较高，与原研制剂差异较大，其余厂家与原研制剂相差不大，结果见图1。

图1 重均分子量测定结果

3.2 分子量分布结果 采用各企业标准测得的部分样品分子量与分子量分布与原研制剂方法测定结果有一定差异，原研方法与各企业方法相比，小于2 000的级分均有所降低，而大于8 000的级分略有升高，2 000～8 000的级分变化不明显；各企业样品均采用原研制剂的方法进行检测，可看出不同企业的分子量分布也有所不同，重均分子量越高，大于8 000的级分比例越大，小于2 000的级分比例越小，企业B、C、D与原研制剂较一致，其余3家企业分子量分布与原研制剂有一定差异，这与重均分子量的检测结果相一致，结果见图2～4。

图2 小于2 000的级分测定结果

图3 2 000～8 000的级分测定结果

图4 大于8 000的级分测定结果

4 讨论

目前依诺肝素钠注射液的7家生产企业均采用不同的质量标准，对照品来源也各有不同，分别为EP、USP、WHO，目前中检院也标定了低分子肝素钠对照品用于分子量与分子量分布检查，国内各企业均采用的是EP和USP的对照品，其中EP为宽分布对照品，利用紫外和示差检测器，根据紫外图谱和示差图谱的峰面积及时间差计算每个时间点的分子量，与保留时间拟合三阶校准曲线[8]，该方法需要人工选点，选点不同对结果有一定影响，计算较复杂，小分子量片段结果不够精确[9]；USP采用两套窄分布校正对照品，使用示差检测器，以各峰的保留时间与Mr拟合三阶校准曲线，该方法较为准确，但其对照品制备困难，价格昂贵[7]；而依诺肝素钠注射液中国药典征求意见稿(2017年)方法与原研制剂的方法一致，采用的是中检院对照品和WHO对照品，这两种对照品均给出了宽分布标样表，根据表中给出的相对分子质量与累积峰面积百分比拟合三阶校准曲线，二者所提供的分子量分布一致，我们进行了2个对照品的比较，发现二者无显著性差异，该方法采用示差检测器，操作简单，测定数据稳定。不同分子量与分子量分布方法及不同来源对照品的测定结果存在差异，采用各企业标准的方法无法有效评价不同产品的质量。我们同时采用原研制剂的方法测定了中国市场、美国市场、欧洲市场原研制剂的分子量与分子量分布，发现不同来源的原研制剂分子量与分子量分布差异不大，但国内部分企业与原研制剂相比差异较大。因此我们建议参照中国药典征求意见稿尽快统一质量标准，为提高仿制药与原研制剂的一致性，更好的控制产品质量提供依据。