液相色谱测定单糖与二糖和低聚半乳糖的方法研究

车永进+岳子贺+戚克进

摘 要：目前有多种方法可以测定低聚糖中各种组分的含量，包括毛细管电泳定量分析、气相色谱法、薄层层析法]和高压液相色谱法，其中高压液相色谱法因操作方便、分析速度快而被广泛应用。高压液相色谱法又根据检测器的不同分为：紫外可见光二极管阵列检测器检测（UV-DAD）、脉冲安培检测器定量分析、和示差折光检测器检测[等。该研究采用高压液相色谱分析，示差折光检测器检测，尝试采用Zorbax Carbohydrate柱、Aichrom-NH2和Sugar Pak Ι三种色谱柱同时检测样品中的葡萄糖、乳糖和低聚半乳糖中三糖、四糖和五糖，确定最佳的色谱分析柱和色谱操作条件。

关键词：液相色谱 测定 单糖 二糖 低聚半乳糖

中图分类号：TH86 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2017）07（b）-0108-02

由于人体肠道内不具备分解消化低聚半乳糖的酶系统， 因而低聚半乳糖在体内不能被胃酸和胃酶降解， 故不能被消化吸收， 而是直接进入小肠内被有益菌尤其是双歧杆菌利用， 对人体发挥独特的生理功能，因此被定义为“益生元”，它能有效促进体内双歧杆菌的生长繁殖，改善脂质代谢，促进钙的吸收和维生素的合成，具有分解致癌物质、提高人体免疫力等功能。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

仪器：高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；电子天平AR3130（奥豪斯仪器（上海）有限公司）；液相色谱柱分别为Zorbax Carbohydrate（4.6×150 mm，美国安捷伦科技有限公司）、氨基柱Aichrom-NH2（4.6×250 mm，美国Abel工业有限公司）和Sugar Pak Ι（4×300 mm，美国Waters公司）。

材料：葡萄糖、乳糖由美国sigam公司提供，低聚半乳糖（其中含半乳三糖、四糖和五塘）由烟台华海生物制品有限提供。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱柱的选择

各种糖组分的含量分析采用高效液相色谱法。色谱系统为美国安捷伦公司提供的Agilent 1200，色谱柱分别为Zorbax Carbohydrate（4.6×150 mm，美国安捷伦公司）、氨基柱Aichrom-NH2（4.6×250 mm，美国Abel工业有限公司）和Sugar Pak Ι（4×300 mm，美国Waters公司）。如果没有特别说明，则色谱条件为：G1362A 示差折光检测器，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，柱温25 ℃，前面两种柱子采用乙腈与水的混合液为流动相，调整流动相组成使其达到最佳分离效果；Sugar PakⅠ的流动相为双蒸蒸馏水。

1.2.2 流动相组成的选择

流动相为乙腈与水的混合物，体积比分别为65∶35、70∶30和75：25，比较不同流动相组成对分离效果的影响。

1.2.3 洗脱流速的选择

洗脱流速分别为0.5、1和1.5 mL/min，比较不同的洗脱流速对分离效果的影响。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

Zorbax Carbohydrate、Aichrom-NgH2、Sugar Pak Ι中的三种色谱柱都能够有效地分离低聚半乳糖中的各种组分，进行定性或定量测定。但Sugar Pak Ι柱在使用一段时间后，柱效很快降低，可能是因为Sugar Pak Ι中的固定相为钙型阳离子交换树脂，低聚半乳糖样品中存在的少量阳离子（原料生产时缓冲溶液中的少量离子，或用少量NaOH调整 pH值时带入的钠离子）很容易将固定相树脂中的钙离子置换下来，不但严重影响测定结果的重现性，而且大大降低色谱柱的使用寿命，并且Sugar Pak Ι的价格约是另外两种柱子的3倍，因此，该研究中糖溶液不适宜用Sugar Pak Ι进行分析。

氨基柱Zorbax Carbohydrate 和Aichrom-NgH2价格相当，实验条件下分析低聚半乳糖混合物，Zorbax Carbohydrate柱比Aichrom-NH2出峰快，分析时间短，色谱柱的理论塔板数高。虽然两种柱子对各种糖组分的选择性相差不大，但前者分离各种糖组分的分离度明显高于后者；采用Aichrom-NH2柱分析，只对葡萄糖和乳糖的分离度超过了1.5，其他各种糖组分之间的分离度都小于1.5。因此氨基柱Zorbax Carbohydrate的分离效果更好，故该研究后面的实验都采用Zorbax Carbohydrate柱对低聚半乳糖进行定性和定量分析测定。

2.2 流动相组成的确定

色谱条件：Zorbax-Carbohydrate色谱柱（4.6×150 mm），柱温25 ℃，G1362A示差检测器，流动相流速1 mL/min，进样量20 μL，流动相为乙腈与水的混合物，体积比分别为65∶35、70∶30和 75∶25，得到不同流动相组成对低聚半乳糖的分离效果。

随着流动相中乙腈含量的增加，流动相的非极性增强，各种糖组分在柱中的保留时间增加，分离度增大。乙腈与水的比例为65∶35时，分析一个样品只需要7 min，流动相比例为75∶25时，分析一个样品需17 min。但从上述结果可以看出，流动相比例为65∶35的选择性和分离度也最小，只有葡萄糖和乳糖之间的分离度大于1.5，其他各种糖组分之间的分离度都小于1.5，而流动相比例为70∶30和75∶25的分离度都远远大于1.5，并且分离度和选择性相差不大，而前者比后者出峰时间早，分析一个样品可以节约5 min，故确定最佳的流动相比例为70∶30。

2.3 流动相流速的确定

流动相的流速影响塔板高度，从而影响分离效果。流动相流速太快，柱效降低，但流速太慢，又会因增加扩散而降低分离度。该研究分别考察了流动相流速分别为0.5、1.0和1.5 mL / min的分离效果。

可以看出：流动相的流速越大，出峰越快，色谱峰越窄，分离的理论塔板数越多，同时选择性越小，分离度也越小。但3个流速下的分离度均大于1.5，这表明各种糖组分都已完全分离。相比之下，流速为1.0和0.5 mL/min时，其分离度和选择性均优于1.5 mL/min，而且柱压较低。1.0和0.5 mL/min的分离度和选择性相差不大，而1.0 mL/min的出峰速度快，分析一个样品比后者要节约10 min，故取1.0 mL/min为最佳洗脱流速。

3 结语

根据色谱柱同时分离单糖、二糖和低聚半乳糖组分的分离度和选择性，以及色谱柱的价格和使用寿命，确定安捷伦公司的Zorbax Carbohydrate 柱可以很好地定性分析和定量测定单糖、二糖和低聚半乳糖混合物中各种组分的含量。最佳的色谱分离条件为：采用示差折光检测器检测，流动相为乙腈与水的混合物，体积比70∶30；洗脱流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量20 μL。

参考文献

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