14C-吡虫啉在苗期油菜中的吸收、转运与分布特性

李成名 聂恩光 张素芬 叶庆富

(浙江大学原子核农业科学研究所/农业部核农学重点实验室，浙江 杭州 310029)

新烟碱类杀虫剂作用于昆虫的乙酰胆碱受体，扰乱其神经活动，对害虫有触杀和胃毒作用，其作用机制与天然烟碱类似[1-2]。吡虫啉(Imidacloprid)作为全球首个商品化的新烟碱类杀虫剂，迄今已在120 余个国家、数百种作物上登记使用[3-4]。尽管吡虫啉已投入使用30 余年，但人们对其环境行为的认识仍不够客观、全面[5-6]。2007年，Cox-Foster 等[7]首次发现，以吡虫啉为代表的新烟碱类杀虫剂会引发“蜂群崩溃综合症”。2012年，Henry 等[8]和Whitehorn 等[9]又相继报道，新烟碱类杀虫剂会减弱蜜蜂觅食能力并降低蜂群增长速率及蜂王的繁殖能力。另有研究表明，新烟碱类杀虫剂吡虫啉在水域环境中分布广泛[10]，且对水生及陆生无脊椎动物(如底栖动物、蜉蝣稚虫、甲壳虫和苍蝇等)具有致死作用[5，11-12]。Hallmann 等[13]研究发现，新烟碱类杀虫剂吡虫啉可能通过营养级联效应引发自然生态系统灾害，如在吡虫啉严重污染的水环境区域，无脊椎昆虫大量死亡，并在营养级联效应的作用下，食虫鸟类种群和数量也急剧下降。为了遏止新烟碱类农药对生态环境的持续性危害，欧盟决定从2013年12月1日起对吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺实施限用政策，美国、加拿大和巴西等国家也相继实行禁限令或展开相应的审查和复审工作。自2018年9月1日，法国开始在全国范围内禁止使用新烟碱类杀虫剂。目前，吡虫啉仍是国内使用频度较高的杀虫剂之一[14-16]，因此，研究吡虫啉在农业生态系统中的行为规律对其科学使用具有重要的现实意义。

油菜(Brassica napusL.)是世界四大油料作物之一。据国家统计局数据显示，2017年我国油菜籽播种面积665.30 万hm2，油菜籽产量约为1 327.41 万t[17]。在油菜生产中，油菜蚤跳甲和油菜黄曲条跳甲等虫害时常威胁油菜的生长，吡虫啉可有效抑制该虫害的发生[18]。然而，目前国内外主要侧重于吡虫啉环境毒理以及残留监控等方面的研究，而有关其在油菜中的吸收、运转与残留定向积累等方面的研究尚鲜见报道。本试验以14C-吡虫啉为示踪剂，采用种衣剂拌种方式处理油菜种子，研究14C-吡虫啉在苗期油菜植株中的吸收、运转与残留分布特征，以期为客观评价吡虫啉的环境安全和农产品质量安全提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试标记化合物14C-吡虫啉，购自上海启甄环境科技有限公司。放射化学纯度为97.35%，化学纯度为98.03%±0.10%，比活度为6.54×105Bq·mg-1。化学结构式如图1 所示。供试种衣剂为60%高巧悬浮种衣剂(有效成分含量600 g·L-1)，登记证号LS99041(FS600)，购自拜耳作物科学(中国)有限公司。供试油菜品种为甘蓝型油菜浙大619，由浙江大学农业与生物技术学院周伟军教授提供。

本试验选用中性黄松土，取自浙江省杭州市浙江大学校内，土壤有机质含量30.5 g·kg-1，pH 值7.02，阳离子交换量(cation exchange capacity，CEC)10.83 cmol·kg-1，粘粒8.0%，粉粒71.3%，砂粒20.8%。

图1 14C-吡虫啉化学结构(*表示14C 标记位置)Fig.1 Chemical structure of 14C-Imidacloprid(* represents the position of 14C)

1.2 试验设计

1.2.114C-吡虫啉不同药种比种衣剂的配制与引入 参考Laurent 等[19]和黄芳等[20]吡虫啉包衣处理油菜种子的方法，并作适当改进。拜耳公司对油菜种子的吡虫啉种衣剂推荐剂量范围是4.8～7.2 g·kg-1。本试验设计的供试药种比均在拜耳公司推荐的田间使用量范围内，分别设置了T1(4.8 g·kg-1)、T2(5.4 g·kg-1)、 T3(6.0 g·kg-1)、T4(7.2 g·kg-1)共4 个药种比，同时以不添加吡虫啉的油菜种子作为空白对照。取0.5 mL 60%高巧悬浮种衣剂，加水定容至5 mL，配成母液A，有效成分为60 mg·mL-1；另采用比活度为6.54×105Bq·mg-1的14C-吡虫啉原药和母液A，制备出有效成分浓度为60.07 mg·mL-1、比活度为2.01×105Bq·mg-1的14C-吡虫啉母液B。分别吸取40、45、50 和60 μL14C-吡虫啉母液B，加水定容至500 μL。每组称取0.5 g 油菜种子(约114 粒)于1 mL 离心管中进行拌种，拌种时用塑料薄膜包裹，防止药液挥发，振荡混合均匀，超声3 min 后，阴干备播。

1.2.2 苗期油菜的培养与取样 取阴干后的油菜种子播于装有120 g 土的塑料杯(200 mL)中，每杯播种1 粒。模拟田间条件培养，至三叶始期第一次取样，而后每隔7 d 取样一次，每次取样6 个重复，共取样5次。

1.3 测定项目与方法

将油菜整株取出，用自来水冲洗干净附着土壤后，将植株按根、茎、叶分离处理，叶片自下往上记为叶1、叶2、叶3、叶4。将样品于60℃烘箱中烘干至恒重并分别记录其干重。取约1 g 干样于生物氧化燃烧仪中，放射性物质氧化燃烧后转化为14CO2，经15 mL 闪烁液B(闪烁液B 配方:28 g 2，5-二苯基恶唑，2 g 1，4-双[2-(5-苯基恶唑)]，2.4 L 二甲苯，0.9 L 乙二醇乙醚，超声0.5 h 溶解后，加入0.7 L 乙醇胺)。吸收静置后，采用Tricarb-2910TR 液体闪烁测量仪(美国Perkin Elmer 公司)测定14C 放射性活度，并计算吡虫啉残留在各样品中的含量。另外，于三叶始期后21 d时每处理另取1 株油菜幼苗，杀青、烘干、压片处理，暗室下曝光37 d 后，采用Typhoon FLA 9500 同位素磷屏与多功能激光扫描成像系统(美国General Electric 公司)进行放射性自显影成像。

根据公式计算14C-吡虫啉吸收利用率、14C-吡虫啉分配比、14C-吡虫啉含量和14C-吡虫啉转运系数:

式中，k为14C-吡虫啉吸收利用率，%；PA 为拌种后每粒油菜种子测定的放射性活度，Bq；TA 为植物体内总放射性活度，Bq。

式中，r为14C-吡虫啉分配比，%；TA 为植物体内总放射性活度，Bq；Ti 分别为根、茎、叶中的放射性活度，Bq。

式中，c为14C-吡虫啉含量，mg·kg-1；Ai 为干样中的放射性活度，Bq；a为母液B 中吡虫啉的放射性比活度，2.01×105Bq·mg-1；Mi 为干样质量，kg。

式中，TF 为14C-吡虫啉转运系数；Cs 为植物体内地上部吡虫啉含量，mg·kg-1；Cr 为植物体地下部的吡虫啉含量，mg·kg-1。

1.4 数据分析

数据采用Excel 2016 进行处理，并用Origin 9.1作图，采用Duncan’s multiple range test 法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 油菜种子中14C-吡虫啉种衣剂的包覆率分析

农药包覆率体现了该试验条件下农药包衣处理种子的药液利用水平。各处理组的种衣剂包覆率如表1所示。结果表明，每粒种子的包覆量随处理浓度的升高而增加，药种比为4.8、5.4、6.0、7.2 g·kg-1时，每粒种子中14C-吡虫啉种衣剂的包覆量分别为1.18、1.41、1.52、1.81 kBq/粒；各处理组14C-吡虫啉种衣剂对油菜种子的包覆率在27.83%～29.46%范围内。

表1 14C-吡虫啉种衣剂对油菜种子的包覆率Table 1 Coated ratio of 14C-Imidacloprid on rapeseeds by seed coating

2.2 苗期油菜体内14C-吡虫啉的吸收和残留动态

苗期油菜对14C-吡虫啉的吸收利用率随时间的变化如图2 所示。结果表明，苗期油菜对14C-吡虫啉的吸收利用率呈现T3＞T4＞T2≈T1的规律。在整个培养过程中，低药种比T1和T2对14C-吡虫啉的平均吸收利用率分别为9.32%和8.55%，二者之间无显著差异(P＞0.05)。高药种比T3和T4对14C-吡虫啉的吸收利用率均显著高于T1和T2(除T4的28 d 外)(P＜0.05)，T3对14C-吡虫啉的吸收利用率在20.20%～28.92%范围内，T4在14.50%～19.17%之间。此外，整个试验过程中，T3对14C-吡虫啉的吸收利用率均显著高于其他3 个处理组，即药种比6.0 g·kg-1处理时，苗期油菜对吡虫啉的吸收效率最高。

图2 苗期油菜对14C-吡虫啉吸收利用率的动态变化(n＝6)Fig.2 Dynamics of uptake percentage of 14C-Imidacloprid in rape seedlings (n＝6)

苗期油菜植株内的14C-吡虫啉含量随时间变化如图3 所示。统计分析表明，在三叶始期，T2、T3和T4植株内的14C-吡虫啉含量均显著高于T1(P＜0.05)，而T3与T2之间差异不显著，T4显著高于T2(P＜0.05)；随后的培养时间内，植株体内的14C-吡虫啉含量表现为高药种比T3和T4显著高于低药种比T2和T1(P＜0.05)，而2 个高药种比处理之间无显著性差异，且两处理植株内的14C-吡虫啉含量均随培养时间延长而下降，分别由7.96 和9.42 mg·kg-1(0 d)下降至4.72 和4.20 mg·kg-1(28 d)。此外，在三叶始期后0 ～14 d 期间，T2植株体内的残留含量极显著高于T1(P＜0.01)，而在三叶期后21 和28 d，植株体内的14C-吡虫啉含量表现为T2和T1之间差异不显著，二者均维持在相对较低的水平(1.69 ～1.97 mg·kg-1)。植株体内14C-吡虫啉的残留量水平与其杀虫能力有关，试验结果显示，相对较高药种比T3和T4处理的杀虫能力显著高于较低药种比T1和T2，且药种比6.0 mg·kg-1处理(T3)能达到与药种比7.2 mg·kg-1处理(T4)相近的杀虫能力。

图3 苗期油菜植株中14C-吡虫啉含量的动态变化(n＝6)Fig.3 Dynamics of 14C-Imidacloprid content in rape seedlings (n＝6)

图4 苗期油菜不同部位的14C-吡虫啉含量及分布Fig.4 Distribution of 14C-Imidacloprid content in different parts of rape seedlings

2.3 苗期油菜不同部位14C-吡虫啉的含量和分布的动态变化

油菜根、茎、叶中的14C-吡虫啉含量及分布动态如图4 所示。低药种比T1和T2茎中的14C-吡虫啉含量显著高于植株其他部位(P＜0.05)，其最大值(T1为19.29 mg·kg-1，T2为25.26 mg·kg-1)均出现在三叶始期，最小值(T1为4.60 mg·kg-1，T2为4.84 mg·kg-1)均出现在三叶期后28 d，且下部叶(叶1)的14C-吡虫啉含量高于其他叶。T1的茎中14C-吡虫啉含量在三叶期后7～21 d 变化不显著(P＞0.05)，随后明显下降，而T2的茎中14C-吡虫啉含量在三叶期后7～14 d 变化较小，三叶期后14 d 开始显著下降(P＜0.05)。与低药种比T1和T2相比，高药种比T3和T4的14C-吡虫啉含量呈现不同的分布规律，其茎和叶1 中的14C-吡虫啉含量均显著高于其他部位(P＜0.05)，在整个培养周期中的各取样时间点，T3和T4叶片中14C-吡虫啉含量均显著高于T1和T2相应的叶片(P＜0.05)，说明高药种比种衣剂处理时，苗期油菜吸收的吡虫啉更易在叶片(尤其是下部叶片)积累，这有利于控制苗期油菜叶片的虫害。除T3三叶始期外，T3和T4各取样时间点苗期油菜根部的含量的14C-吡虫啉含量均显著高于T1和T2(P＜0.05)。

由图5 可知，高药种比T3和T4的分配比与低药种比T1和T2呈现出不同的分布特征。具体来看，T1和T2的分配比规律为:茎＞叶＞根，而高药种比T3和T4的分配比规律则为:叶＞茎＞根(T4在三叶期后28 d除外)。各处理组根中14C-吡虫啉的分配比均在9.81%～16.37%范围内。

图5 苗期油菜根、茎、叶中14C-吡虫啉的分配比(n＝6)Fig.5 Distribution ratio of 14C-Imidacloprid in roots，stems and leaves of rape seedling (n＝6)

2.4 14C-吡虫啉在苗期油菜植株中的放射自显影

三叶始期后21 d 时，油菜植株的放射自显影成像如图6 所示。可见，不同药种比处理植株体内14C-吡虫啉及其代谢产物主要分布在茎和叶片，根中相对较少，且高药种比处理油菜的根、茎、叶中14C-吡虫啉含量均高于低药种比，这与前文定量分析结果可相互印证。放射自显影结果还表明，苗期油菜的叶缘部位的14C-吡虫啉(包括代谢产物)含量相对于叶片其他部位更高，即14C-吡虫啉更易在叶缘部位定向积累。

图6 三叶期后21 d 苗期油菜的放射自显影图(a)和植株实物图(b)Fig.6 Autoradiography (a) and physical map (b) of rape seedlings on the 21th day after the three-leaf stage

2.5 14C-吡虫啉在苗期油菜中的转运分析

14C-吡虫啉在苗期油菜中的转运系数动态变化如表2 所示。结果显示，在整个试验过程中，14C-吡虫啉在油菜幼苗中的转运系数均大于1，表明在种衣剂拌种处理油菜种子方式下，吡虫啉容易通过根部向地上部转运，且随着培养时间延长，各处理组14C-吡虫啉的转运系数逐渐降低。从三叶始期至采样终点，T1、T2、T3和T4的吡虫啉转运系数分别下降了63.38%、74.82%、60.84%和80.65%。在三叶始期，各处理组之间的转运系数无显著差异，说明三叶始期时，油菜幼苗对14C-吡虫啉的转运系数与药种比之间无明显相关性。就高药种比T3和T4而言，在三叶始期(0 d)至三叶期后7 d，两处理的14C-吡虫啉转运系数无显著差异，而随着培养时间延长，T3的转运系数均显著高于T4。

表2 14C-吡虫啉在苗期油菜中的转运系数动态变化Table 2 Dynamics of transport factors of 14C-Imidacloprid in rape seedlings

3 讨论

3.1 吡虫啉种衣剂处理甘蓝型油菜种子的适宜药种比

新烟碱类杀虫剂吡虫啉通过与昆虫乙酰胆碱受体结合，干扰昆虫神经系统进而达到杀虫防害的效果[21]，其对昆虫的半致死量(lethal dose 50%，LD50)为2.0 mg·kg-1[22]。探索化学农药的高效利用机理以及开发农药减量增效技术是我国当前的研究热点之一[23]。在推荐剂量范围内，确定更适宜的药种比以减少其用量，进而减少化学农药污染，降低农药用药成本，具有重要的现实意义。

本试验表明，吡虫啉种衣剂拌种处理油菜种子，相较于T1、T2和T4，药种比6.0 mg·kg-1处理(T3)的苗期油菜对吡虫啉的吸收利用率最高。同时，苗期油菜植株体内的吡虫啉总含量水平表现为高药种比T3和T4显著高于低药种比T2和T1(除三叶始期外)(P＜0.05)，而高药种比处理间无显著性差异(P＞0.05)，两者吡虫啉含量水平分别维持在4.72 ～7.96 mg·kg-1和4.20～9.42 mg·kg-1范围内；苗期油菜叶中高药种比的吡虫啉含量水平也显著高于低药种比(P＜0.05)。植株体内的吡虫啉含量与其虫害防御能力有关，高药种比处理的植株整体含量及叶中的含量均高于低药种比，这意味着高药种比处理有利于控制油菜植株整体尤其是叶片的虫害。此外，在取样后期，药种比6.0 g·kg-1处理(T3)14C-吡虫啉在油菜体内的转运系数均显著高于药种比7.2 g·kg-1处理(T4)。综上所述，药种比6.0 g·kg-1为吡虫啉种衣剂处理油菜种子的适宜药种比。

3.2 吡虫啉在植物体内的转运及分布差异性的可能机理

本研究表明，油菜种子经高药种比处理，其植株体内14C-吡虫啉含量和放射性分配比均呈现出与低药种比处理不同的特征。低药种比处理，茎中吡虫啉含量水平显著高于植株其他部位(P＜0.05)，且下部叶(叶1)高于其他叶，其分配比规律为:茎＞叶＞根。而高药种比处理，茎和叶1 中吡虫啉含量均显著高于其他部位(P＜0.05)，其分配比规律则为:叶＞茎＞根(T4三叶期后28 d 除外)。各处理组根中14C-吡虫啉的分配比均较低，在9.81%～16.37%范围内。Laurent 等[19]研究表明，向日葵种子经过吡虫啉拌种后，约10%进入到种子中，下部叶片吡虫啉含量高于上部叶片。Ge等[24]有关吡虫啉在水稻植株中吸收与运转的研究表明，吡虫啉从土壤引入水稻后，叶片的吡虫啉含量高于根部。Sun 等[25]研究也表明，水培条件下玉米植株体内吡虫啉的分布也呈现出叶＞茎＞根的规律。这些研究报道与本试验研究结果类似。

由本研究结果可知，吡虫啉在苗期油菜中的转运系数均大于1，表明在种衣剂拌种处理油菜种子方式下，吡虫啉易通过根部向地上部转运。农药在植株体内各部位分布差异可归因于多因素的影响。农药分子的结构、正辛醇/水分配系数(logKow)、溶解性等理化性质对其内吸性能影响较大[26]。通常认为，当logKow小于4 时，农药分子在植物的木质部传导能力较强，容易向上运输；当logKow 大于4 时，农药分子亲脂性较强，不易向上运输[27]。吡虫啉的logKow 为0.57[28]，亲水性较强，因而易通过植株木质部向地上部运输。这可能是本研究中吡虫啉地上部含量高于根部的原因之一。

植物的蒸腾作用是农药分子在植物体内吸收和转运另一个重要因素[29]。已有研究表明，内吸性杀虫剂均能不同程度的透过角质层到达植物内部，而后随着植物的蒸腾作用到达植株各部位[30]，由于叶片边缘布满气孔，植物体内的农药分子可在蒸腾流的作用下运输至叶片边缘。本试验放射自显影结果进一步证实，14C-吡虫啉(包括代谢产物)主要分布在茎和叶中，尤其是叶缘部位，即14C-吡虫啉更易在叶缘部位定向积累。Tapparo 等[31]用吡虫啉处理玉米种子时也发现，植株吐水时其叶尖端液滴中含有吡虫啉。可见，吡虫啉易在叶缘部位积累这一现象符合蒸腾作用影响植物对农药分子吸收和转运的规律。

种衣剂拌种处理油菜种子后，随着培养时间延长，苗期油菜对吡虫啉的转运系数逐渐降低。杨丽旋[32]在0.5 mg·L-1吡虫啉水培条件下处理上海青和紫金香妃青菜，发现随着培养时间延长，其转运系数分别从1.91 和2.77 降至1.81 和1.14，这与本试验的研究结果类似。究其原因，可能是随着培养时间的延长，油菜植株生物量的增加速率超过了吡虫啉在地上部的累积速率，从而表现出转运系数随时间延长而下降的现象。

4 结论

本试验研究了14C-吡虫啉在苗期油菜中的吸收、转运和分布规律，结果表明，吡虫啉种衣剂处理油菜种子的适宜药种比为6.0 g·kg-1；低药种比4.8 和5.4 g·kg-1处理，14C 吡虫啉在各部位的分配比规律为:茎＞叶＞根；高药种比6.0 和7.2 g·kg-1处理时，其分配比规律则为:叶＞茎＞根；吡虫啉更易在叶缘部位定向积累；吡虫啉在油菜幼苗中的转运系数均大于1，且吡虫啉的转运系数随着油菜培养时间延长而降低。本研究为农业生产上科学使用吡虫啉和客观评价吡虫啉安全性提供了数据支撑和理论依据。