硝态氮和铵态氮对玉米幼苗中吡虫啉积累和分配的影响

何 琴，张兴兴，赖鉴添，邵丹青，周宇明，申建梅，卢颖林，安玉兴

1.仲恺农业工程学院资源与环境学院，广东 广州 510225；2.广东省科学院南繁种业研究所/广东省药肥工程技术研究中心，广东 广州 510316；3.华南农业大学植物保护学院，广东 广州 510642）

【研究意义】玉米（Zea maysL.）作为我国传统的三大主粮作物之一，在“经-粮-饲”三元种植结构体系中扮演着十分重要的作用，其产量的稳定性决定了我国粮食市场的供给平衡。农药和化肥施用是保证玉米高产的重要措施，但不合理使用也会带来农田土壤酸化、土壤板结、土壤微生物多样性降低以及食品农药残留超标、大气及水体污染等诸多环境和食品安全问题［1］。吡虫啉是一种新型高效氯代烟碱类广谱杀虫剂，可用于螟虫、棉蚜、蓟马、蛴螬等害虫的田间防治［2-5］。2019 年杀虫剂市场调研结果显示吡虫啉在全球的销售额排名第三，销售量排名第四，在全球范围内的使用非常广泛［6］。近年来，喷施和拌种等施药方式下吡虫啉等新烟碱类农药活性成分只有5%左右被农作物吸收，90%进入到农田土壤或大气中，普遍存在利用率低的现象，由此也造成环境污染、生态失衡以及增加人体暴露风险等负面影响［7-11］。提高利用率、减少使用量是降低环境污染和人体吡虫啉暴露风险的重要途径。“药肥一体化技术”是近年来提出的一种新型施药施肥技术，通过科技手段将农药和肥料科学组合、共同施用，达到提高药效和肥效以及省时省工的目的。【前人研究进展】研究显示，30%甜歌多功能药肥（0.32%杀单·毒死蜱，基肥型N∶P2O5∶K2O=10∶10∶10，追肥型N∶P2O5∶K2O=12∶6∶12）兼具营养与杀虫双重功效，可在有效控制常见蔗田害虫的同时促进甘蔗生长［12］。张梦晗等［13］的研究发现吡虫啉种衣剂能够促进小麦幼苗中游离氨基酸和可溶性蛋白的含量，加快植株氮代谢。和锐敏等［14］研究发现吡虫啉与铵态氮共施有利于甘蔗的生长，与硝态氮共施可增加甘蔗的鲜重以及促进根系的生长。【本研究切入点】目前，对吡虫啉如何影响植物氮素代谢以及氮素对吡虫啉在植物中的吸收转运的影响研究较少。【拟解决的关键问题】分析硝态氮和铵态氮对玉米吸收转运吡虫啉的影响，探讨不同形态氮素在玉米幼苗积累和运输吡虫啉过程中的作用，解析其间的传导关系，旨在为玉米生产中氮肥和吡虫啉的合理施用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为超甜金银粟2 号甜玉米，该品种综合性状较稳定，非常适宜在广州地区推广种植［15］，购于广东省农业科学院蔬菜研究所。

1.2 试验方法

试验于2020 年12 月至2021 年4 月在广东省科学院南繁种业研究所广东省现代农业（药肥互作与作物逆境调控）产业技术研发中心进行。试验通过水培方式研究不同氮素对玉米吡虫啉吸收的影响，设置硝态氮（NO3-）和铵态氮（NH4+）2种氮素处理，浓度分别为正常供氮量4 mmol/L 和高浓度供氮量10 mmol/L，吡虫啉处理浓度为1.0、2.5、5.0 mg/L，共12 个处理，每个处理3 次重复。

1.2.1 植物材料培养 玉米种子用去离子水清洗，5%次氯酸钠浸泡15 min 后再用去离子水清洗8～10 次，于25 ℃培养箱中浸种6 h，之后置于湿润的蛭石中萌发，待玉米种子长出两叶一心时将其移栽到有孔有机板上，置于盛有4 种不同营养液（pH，5.6～5.8）的塑料盒中，每盒9 株苗，每隔2 d 完全更换1 次营养液。营养液配置方法见表1。

表1 改良Hoagland 营养液成分Table 1 Composition of the improved Hoagland nutrient solution

玉米幼苗生长环境为人工培养箱，生长条件：白天温度25 ℃、时间16 h，夜间温度20 ℃、时间8 h，相对湿度为60%～80%。

1.2.2 植物材料处理 玉米材料在营养液中培养15 d 后，营养液加入吡虫啉处理，处理浓度设置为1.0、2.5、5.0 mg/L，每个处理3 次重复。继续培养15 d 后，用二氯乙烷清洗玉米根部15 s，再用去离子水清洗干净、吸水纸擦干，最后分别收取根、茎和叶并用液氮保存备用。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 吡虫啉含量测定（1）标准曲线绘制。用分析天平准确称取一定量的吡虫啉标准品，用乙腈充分搅拌使其溶解，配制成质量浓度为1.0 g/L的标准母液，再梯度稀释为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L 的系列标准工作溶液，每个浓度3 个重复，经0.22 μm 有机微孔过滤膜过滤进入进样瓶，待测。吡虫啉浓度的检测采用高效液相色谱仪，采用Agilent Zorbax TC-C18 检测柱，流动相为（水∶乙腈）=70 ∶30，柱温30 ℃，进样量10 mL，流速1 mL/min，检测器波长270 nm。以测定浓度为横坐标（X）、其对应峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归计算，求得吡虫啉的标准曲线为Y=479.06X+1.3853，R2=1.00。

（2）玉米幼苗中吡虫啉含量测定。采用高效液相色谱法测定吡虫啉残留含量的检测方法，略作改动：分别称取玉米幼苗根、茎、叶1.0 g 研磨成粉末，加入2 mL 乙腈，静置提取30 min；依次向离心管中加入无水硫酸镁0.2 g、氯化钠0.3 g，振荡器震荡1 min 后7 000 r/min 离心5 min；取1.5 mL 上清液，加入到含有无水硫酸镁0.15 g 和石墨化碳黑0.02 g 的2 mL 离心管中，振荡1 min 后在5 000 r/min 下离心5 min，用一次性无菌注射器吸取上清液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤至HPLC 进样瓶中，上机测定，根据标准曲线计算样品中吡虫啉含量。

1.3.2 玉米各部位吡虫啉生物富集因子和转运因子计算方法 玉米幼苗对吡虫啉的吸收潜力和富集程度用生物富集因子（Bioconcentration factors，BCFs）表示［16］，吡虫啉在玉米幼苗体中的转运程度用转运因子（Translocation factors，TFs）表示：

根部生物富集因子（RCF）=C根/C液

茎部生物富集因子（SCF）=C茎/C液

叶部生物富集因子（LCF）=C叶/C液

根到茎的转运因子（TF茎/根）=C茎/C根

茎到叶的转运因子（TF叶/茎）=C叶/C茎

式中，C根、C茎、C叶分别为玉米幼苗根、茎、叶中的吡虫啉含量，C液为营养液中吡虫啉的浓度。

试验数据采用 IBM SPSS Statistics 20 进行统计，采用LSD进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 硝态氮和铵态氮处理对玉米幼苗吡虫啉含量的影响

为研究营养液中吡虫啉添加量对玉米幼苗根、茎、叶中吡虫啉积累的影响，利用高效液相色谱仪分别测定1.0、2.5、5.0 mg/L 吡虫啉处理下玉米幼苗根、茎、叶中吡虫啉的含量，结果（图1）显示，吡虫啉含量最高的部位是叶片，其次是根，茎中的含量最低，在4 种氮素供应条件（4、10 mmol/L NO3-，4、10 mmol/L NH4+）下，吡虫啉含量均表现为叶＞根＞茎，表明玉米幼苗叶片是吡虫啉积累的主要部位。当吡虫啉处理浓度升高时，硝态氮为氮源培养的玉米叶片中吡虫啉含量逐渐升高，而铵态氮为氮源的玉米幼苗中吡虫啉含量无显著变化或呈现下降趋势。此外，本研究结果显示氮素形态影响玉米幼苗中吡虫啉的积累。在3 个吡虫啉浓度处理下，当供氮量相同时，以硝态氮为氮源培养的玉米，根、茎、叶中吡虫啉的含量明显高于铵态氮培养的玉米幼苗。以2.5 mg/L吡虫啉浓度处理为例，4 mmol/L NO3-处理根中吡虫啉含量为4 mmol/L NH4+处理的3.09 倍、10 mmol/L NO3-处理为10 mmol/L NH4+处理的5.15倍，茎中分别为1.90、3.04倍，叶中分别为1.70、3.22倍，这也表明叶片是玉米幼苗中吡虫啉积累的主要部位，吡虫啉在玉米幼苗中的积累与其添加量相关，添加浓度越高，玉米幼苗中的积累量越高；氮素形态与玉米幼苗中吡虫啉积累量显著相关，硝态氮为氮源更有利于玉米幼苗中吡虫啉的积累。

图1 不同供氮条件下玉米幼苗根、茎、叶中吡虫啉的含量Fig.1 Contents of imidacloprid in roots，stems and leaves of maize seedling under different nitrogen supply conditions

2.2 硝态氮和铵态氮处理对玉米幼苗吡虫啉生物富集因子的影响

为评估不同氮素形态下玉米幼苗对吡虫啉的吸收潜力和富集能力，分析吡虫啉与不同形态氮素共处理15 d 玉米幼苗不同部位中生物富集因子的变化。从表2 可以看出，在3 个吡虫啉添加浓度下，玉米幼苗中吡虫啉的LCF均显著高于SCF和RCF，表明玉米幼苗叶部对吡虫啉的生物富集能力最强，其次为根部，茎部对吡虫啉的生物富集能力最弱。在氮素供应水平相同的条件下，仅吡虫啉添加量为1.0 mg/L 时4 mmol/L NO3-处理的LCF与4 mmol/L NH4+处理无显著差异，其余硝态氮处理的吡虫啉的LCF、SCF和RCF均大于铵态氮处理。另外，10 mmol/L NO3-处理的LCF、SCF和RCF均大于4 mmol/L NO3-处理，表明较高浓度的硝态氮更有利于玉米幼苗对吡虫啉的富集。除添加吡虫啉浓度为5 mg/L 时4 mmol/L NO3-处理的LCF外，随着吡虫啉浓度的添加，玉米幼苗中吡虫啉的RCF、SCF和LCF均呈下降趋势，两者表现为负相关关系。

表2 不同供氮条件下玉米幼苗根、茎、叶中吡虫啉的生物富集因子（BCFs）Table 2 Bioconcentration factors（BCFs）of imidacloprid in roots，stems and leaves of maize seedling under different nitrogen supply conditions

2.3 不同浓度吡虫啉在玉米幼苗植株中的转运因子

为了研究氮素形态对玉米幼苗植株中吡虫啉转运的影响，分析吡虫啉与不同形态氮素共处理15 d 后玉米幼苗植株中吡虫啉转运因子（TFs），结果（图2）显示，在吡虫啉添加浓度为2.5 mg/L 时，4、10 mmol/L NO3-和4、10 mmol/L NH4+处理玉米幼苗吡虫啉从根到茎的转运因子均最高，TF茎/根分别为1.02、0.78、1.90、1.32，表明在此浓度下根中的吡虫啉易转移到茎中；在1.0、5.0 mg/L 吡虫啉处理下，TF茎/根均小于1，说明这两种吡虫啉添加浓度下玉米幼苗茎中富集的吡虫啉较少。对于吡虫啉从茎部向叶部的转运，所有处理的TF叶/茎均大于1，在吡虫啉添加浓度为1.0、2.5 mg/L 时，4、10 mmol/L NO3-和4、10 mmol/L NH4+处理的TF叶/茎为1.5～3.5，统计学分析显示除4 mmol/L NO3-处理较小外，其他3 个处理间无显著差异；在吡虫啉添加浓度为5.0 mg/L 时TF叶/茎最高，4、10 mmol/L NO3-和4、10 mmol/L NH4+处理的TF叶/茎分别为7.54、5.07、4.19、4.13，表明在此添加浓度下吡虫啉更易从茎部转运到叶部。与硝态氮处理相比，铵态氮处理玉米幼苗中吡虫啉的TF叶/茎明显较低，且差异达到显著水平，表明在吡虫啉添加浓度为5.0 mg/L 时硝态氮更有利于吡虫啉向叶片中转运。

图2 玉米植株中吡虫啉的转运因子Fig.2 Translocation factors of imidacloprid in maize plant

3 讨论

吡虫啉是第一个新烟碱类杀虫剂商品，因其高效、广谱、低毒等特性广泛应用于作物虫害防治［17］。叶面喷施是吡虫啉的主要给药方式，但在实际生产中这种给药方式存在利用率偏低、环境风险高的问题，因此，根施吡虫啉的方式越来越被人们重视［18-20］。对于大多数作物来说，叶片是主要受害部位，吡虫啉能否通过根部运输到叶片是改变施药方式的限制因素。Van 等［21］研究表明，在相同给药量下，盆底施药更有利于温室作物对吡虫啉的吸收和富集，在根部施药方式下吡虫啉的药效高于滴灌和喷施。Han 等［7］研究也表明，根部施药方式下吡虫啉可以被烟草吸收并运输到植株各部位，且分布更均匀、持效性更好。本研究结果显示，吡虫啉能够通过根部进入玉米体内，运输到茎部和叶部，主要积累在叶部，表明根施吡虫啉的施药方式对防治玉米地上部虫害是可行的。

农药在植物体中的积累受多种因素影响。农药的理化性质（如分子量、水溶解性、疏水性以及分子结构）可影响植物根系对农药的吸收和富集［22-23］。此外，植物自身的蒸腾作用以及物质转运通道也与农药的吸收和运输有关［24-25］。Sur等［20］研究表明吡虫啉被根吸收后，从木质部转移到植物顶端。李成名等［26］、Li 等［27］研究表明，吡虫啉在不同蔬菜品种、不同生长阶段的吸收和转运存在差异，这种差异可能与蔬菜根系中吡虫啉的日蒸腾量和浓缩能力有关。鞠超［28］的研究显示，吡虫啉在小麦中主要通过共质体途径吸收，根部吡虫啉含量及转移系数、根部蛋白质含量和蒸腾率分别是根吸收富集吡虫啉的主要因素和次要因素。本研究结果显示，吡虫啉的积累量与氮素形态密切相关，在相同供氮量下，硝态氮为氮源时玉米幼苗各部位吡虫啉含量显著高于铵态氮，生物富集因子结果也显示硝态氮处理的吡虫啉LCF、SCF和RCF均大于铵态氮处理，3 个不同浓度吡虫啉添加情况下出现类似结果，表明硝态氮有利于吡虫啉在玉米幼苗中的富集。氮素作为植物需求量最旺盛的矿质元素，对作物生物量和产量起着重要作用。玉米生长发育受氮素形态影响显著。李学俊等［29］研究表明，与其他施氮处理相比，单独施用硝态氮肥的玉米生物量最高；陈冬梅等［29］研究显示，在pH 4.0 和6.0 条件下，硝态氮为氮源时玉米苗期侧根数目和主根长度均高于铵态氮。另有研究表明，与铵态氮为唯一氮源相比，硝态氮处理增加了玉米蒸腾速率和光合作用、提高了自由水含量和细胞活跃度，从而加快了氮素代谢活动，促进了玉米生长［30］。硝态氮为氮源的玉米中积累更多吡虫啉的原因可能是硝态氮可促进玉米根系生长、提高蒸腾速率，有助于玉米根部对吡虫啉的吸收和向茎、叶的运输。

根部是农药进入植物体的主要部位，但是多数害虫的取食部位是茎和叶，因此，农药根-茎-叶的转运对农药的利用率至关重要［31］。Ge 等［32］在水稻中研究显示吡虫啉可被水稻从土壤中吸收，易从根转移到水稻地上部。在油菜中的研究显示，吡虫啉在各部位中的分布与吡虫啉添加量相关，低药种比处理情况下吡虫啉在茎中的含量显著高于其他部位，而在高药种比情况下其分配规律表现为叶＞茎＞根［25］。本研究结果显示，在3 个吡虫啉添加浓度、4 种不同氮供应条件下，玉米幼苗中吡虫啉茎-叶的转运因子均大于1.5，表明吡虫啉易在玉米叶片中富集；另外，在吡虫啉添加量为5 mg/L 时，硝态氮处理下茎-叶的转运因子显著高于铵态氮处理，表明硝态氮更有利于吡虫啉向玉米幼苗叶片中转运。

4 结论

本研究通过水培试验探究不同浓度吡虫啉与不同形态氮素共处理下吡虫啉在玉米中的富集、分配与转运情况，结果表明，叶片是吡虫啉积累的主要部位，吡虫啉添加浓度越高，玉米叶片中吡虫啉富集越多；氮素形态影响玉米对吡虫啉的富集和转运，以2.5 mg/L 吡虫啉浓度处理为例，4 mmol/L NO3-处理根中吡虫啉含量为4 mmol/L NH4+处理的3.09 倍、10 mmol/L NO3-处理为10 mmol/L NH4+处理的5.15 倍，茎中分别为1.90、3.04倍，叶中分别为1.70、3.22 倍。在吡虫啉添加浓度为5.0 mg/L 时TF叶/茎最高，4、10 mmol/L NO3-和4、10 mmol/L NH4+处理的TF叶/茎分别为7.54、5.07、4.19、4.13，表明在此添加浓度下吡虫啉更易从茎部转运到叶部。与硝态氮处理相比，铵态氮处理玉米幼苗中吡虫啉的TF叶/茎明显较低，且差异达到显著水平，表明在吡虫啉添加浓度为5.0 mg/L 时硝态氮更有利于吡虫啉向叶片中转运，在根施吡虫啉防治玉米害虫过程中添加硝态氮肥更有利于提高吡虫啉利用率。