异花授粉对柚果实代谢产物的影响及其与内裂的关系

刘冬峰 林绍生 陈 巍 朱祝军 宋 洋 郭秀珠 李发勇

(1浙江省亚热带作物研究所，浙江 温州 325005；2江苏农林职业技术学院，江苏 句容 212400，3 浙江农林大学，浙江 临安 311300)

裂果是柚果实发育过程中重要的生理病害，主要分外裂和内裂两种类型[1]。外裂是从果顶开始沿果实纵向由外向内开裂，开裂果实裂口较大，丧失商品性；内裂是果实囊瓣在腹线处开裂，主要是种子败育后果皮、囊瓣、中心柱生长不协调导致，内裂果实外观表现正常，但易枯水粒化[2-3]。前人关于多种果实的研究表明，裂果与果肉、果皮中的代谢物含量变化密切相关。随着果实发育，果肉中可溶性糖、有机酸等物质含量增加，果肉薄壁细胞渗透势降低、吸水能力增强[4-6]，而果皮中不溶性果胶逐渐转变为可溶性果胶使果皮韧性降低[7-8]，果肉、果皮生长不协调导致裂果[9-11]。

异花授粉是减轻柚裂果的有效措施，其作用机制可能与花粉直感效应有关[12-13]。异花授粉后，由于花粉直感现象，杂交当代果实在生长发育和品质形成过程中发生明显变异[14-16]。柑橘果实形状、果皮厚度、种子数量及可溶性糖、有机酸、挥发性物质等内在品质性状均表现明显的花粉直感效应[17-19]。种子是花粉直感效应的重要载体，前人研究认为父本花粉可通过种子影响果实组织从而引起果实性状变异，种子合成的内源激素、多胺等物质可调节细胞代谢和果实发育过程，起到提高库容、促进果实生长的作用[20]。柚异花授粉后产生大量饱满种子，有研究认为大量种子排列在中心柱周围，能够缓冲汁胞发育产生的膨压，起到保护中心柱的物理性作用，从而减轻果实内裂[21]。但柚异花授粉果实种子数较多，导致商品性下降，而种子产生的内源物质对中心柱和汁胞发育的影响，以及汁胞代谢变化与果实内裂的关系还有待进一步研究。本研究分析了早香柚果实种子数与内裂的关系，利用气相色 谱 -质 谱 技 术 ( gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)测定早香柚无籽内裂果实和多籽不内裂果实汁胞代谢组，从代谢组水平分析异花授粉对柚果实汁胞代谢产物的影响，以期为研究柚内裂发生机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验在浙江省永嘉县碧莲镇早香柚中心产区开展，树龄25年，处于稳定结果期。花粉来自当地种植的琯溪蜜柚，采集大蕾期花朵的花药，利用白炽灯烘烤干燥的方法收集花粉。开花期，选取8 株正常早香柚结果树，其中4 株进行异花授粉，另外4 株疏花后直接套袋作为对照。第二次生理落果后去除套袋，之后田间常规管理。根据前期研究结果，早香柚未授粉果实裂瓣在盛花后105 d 及其后1 个月内发生并结束[22]，即8月中下旬至9月上旬为早香柚果实内裂发生期。因此于早香柚内裂起始期(8月20日)采集自花授粉的无籽内裂果实和异花授粉的多籽不内裂果实，采用GC-MS 方法检测代谢产物，每个处理测定8 个样本，分析两组样本的代谢产物差异。果实成熟后，采集自花授粉和异花授粉果实各100 个，自花授粉的无籽果实横切后统计果实裂瓣数，剥取异花授粉果实的饱满种子，统计异花授粉果实种子数，并分析其与果实内裂的关系。

1.2 样本制备

代谢组样品制备参照Lisec 等[23]的方法，称取液氮研磨的果肉粉末30 mg 于1.2 mL 预冷甲醇中，涡旋10 s。加入60 μL 核糖醇(0.2 g·L-1)作为内标，涡旋10 s，70℃超声提取30 min。11 000×g离心10 min，取1 mL 上清液于离心管中，加入0.75 mL 氯仿(-20℃预冷)和1.5 mL 蒸馏水(4℃预冷)，涡旋30 s，3 000 ×g离心15 min。取上清液400 μL 于离心管中，氮气吹干。加入50 μL 15 g·L-1甲氧基吡啶溶液，室温反应16 h，然后加入50 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氯乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷)，室温反应60 min，再于10 000×g条件下离心10 min。最后取90 μL 上清液进样，检测设备为Agilent 7890A/5975C 气质联用仪(美国Agilent 公司)，色谱柱为HP-5 MS 毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.3 GC/MS 分析

气相色谱条件:分流进样，进样量1.0 μL，分流比10 ∶1。进样口温度280℃，离子源温度250℃，接口温度150℃。程序升温，起始温度40℃，保持6 min，以10℃·min-1升至300℃，保持6 min。载气为氦气，载气流速1.0 mL·min-1。质谱条件:电喷雾电离(ESI)源，电子能量为70 eV，全方式扫描，四级杆扫描范围m/z 35～780。

1.4 数据处理

将原始GC/MS 数据转换成CDF 格式(Net Channel Definition Format)，利用XCMS 程序(www.bioconductor.org/)进行峰识别、峰过滤、峰对齐，通过手动提取任意质量色谱峰进行验证并确定XCMS 参数，除默认参数外还进行了如下调整:xcmsSet (fwhm=3，snthresh=3，mzdiff=0.5，step=0.1，steps=2，max=300)，retcor [method = obiwarp，plottype = c(deviation)]，bandwidth=2，minfrac=0.3。利用总和标准比(www.metaboanalyst.ca)方法对原始数据进行归一化处理。对获得的保留时间(retention time)、质核比(m/z)、峰强(intensity)等信息的数据矩阵进行代谢物注释，注释所用数据库为NIST 商业数据库(NIST 2008)和Golm Metabolome Database(GMD)，大量物质由于信号低或没有数据库收录没被注释到。利用Simca-P 11.0 软件进行主成分分析( principal component analysis，PCA)和偏最小二乘方-判别分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)，根据PLS-DA 变量对分组贡献值(variable importance in the projection，VIP)大小(阈值＞1)和组间变化的显著性(P＜0.05)筛选显著差异代谢物，并进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)化合物和代谢途径注释。

2 结果与分析

2.1 早香柚果实种子数与内裂的关系

果实成熟期，调查种子数与果实内裂的关系，发现自花授粉的无籽果实全部内裂，异花授粉果实内裂率与种子数量有关。异花授粉果实种子数介于11 ～115粒之间，平均种子数为55 粒/果，种子数少于30 粒时内裂率为100%，高于80 粒时中心柱充实、不内裂，大部分异花授粉果实的种子数介于30 ～80 粒之间，所占比例为72.0%，其中内裂率为51.4%(图1)。早香柚自花授粉果实的裂瓣数多为2、3 瓣，占内裂果实的57.2%，其次为1、4 瓣，裂瓣数超过5 瓣的果实较少(图2)，且裂瓣多处于对称位置，说明果实横向生长拉力是果实中心柱开裂的直接原因。

2.2 GC-MS 数据多元变量分析

图1 早香柚异花授粉果实种子数与内裂的关系Fig.1 The relationship between seed numbers and fruit inner-cracking in cross-pollinated Zaoxiang pomelo

图2 早香柚自花授粉果实裂瓣数Fig.2 The number of cracked-segments in self-pollinated Zaoxiang pomelo

利用Simca-P 11.0 软件对所有样本采用PCA 进行无监督的数据分析，样品分型前首先对数据进行单位方差缩放(unit variance scaling，UV)，以获得更加可靠直观的效果。如PCA 得分图(图3-a)所示，所有样本均处于95%置信区间内，说明模型可用于数据分析。为筛选组间差异代谢物，用PLS-DA 进行有监督的数据分析，并对模型的质量用交叉验证法进行检验，交叉验证后得到的R2X(模型可解释的变量)和Q2(模型的可预测度)对模型有效性进行评判。如PLS-DA 得分图(图3-b)所示，PLS-DA 模型可以很好地解释两组样本间的差异。对PLS-DA 模型进行置换检验(permutation test)验证模型是否过度拟合，得到PLS-DA 置换检验图，100 次验证结果显示，R2 在Y 轴上的截距为0.343，Q2 在Y 轴上的截距为-0.289(图4)。从各组的模型预测参数的R2X、R2Y、Q2Y 来看，上述评估模型是有效、可靠的，可用于差异变量筛选。

2.3 早香柚果实内裂起始期代谢产物的鉴定

图3 PCA 得分图和PLS-DA 得分图Fig.3 PCA score plot and PLS-DA score plot

图4 PLS-DA 模型的置换检验图Fig.4 PLS-DA permutation test graph

根据保留时间、质核比和峰强矩阵进行代谢产物注释，共鉴定到66 种代谢物，包括10 种氨基酸、29 种有机酸、17 种糖类物质、8 种含氮化合物和2种其他物质(表1)。在检测到的333 个目标化合物中，大量物质由于信号低或数据库未收录而没有注释到。采用PLS-DA 模型第一主成分的VIP 值(阈值＞1)结合S-plot 和t 检验的P值(P＜0.05)寻找差异代谢物。

2.4 异花授粉对早香柚果实代谢产物的影响

由表2 可知，果实内裂起始期，在异花授粉果实中鉴定到12 种显著差异的代谢产物，包括7 种有机酸(奎宁酸、琥珀酸、柠康酸等)、3 种含氮化合物(2-咪唑烷酮-4-羧酸、2-硫代巴比妥酸和2-羟基吡啶)和2种糖类物质(阿拉伯糖和山梨醇)，其中阿拉伯糖和2-咪唑烷酮-4-羧酸含量显著上升，奎宁酸、山梨醇等10种代谢物含量显著下降。

表1 早香柚果实内裂起始期代谢产物鉴定结果Table 1 Identified metabolites from Zaoxiang pomelo during initiation period of inner-cracking

表1(续)

表2 早香柚异花授粉果实中显著差异代谢物Table 2 Matebolites with significant difference in cross-pollinated Zaoxiang pomelo

2.5 异花授粉对早香柚果实代谢途径的影响

从外观上看，种子有无及多少是早香柚果实内裂的重要影响因素。代谢物含量分析结果表明，异花授粉后果实中多个代谢途径发生变化(图5)。在鉴定到的10 种氨基酸中，9 种为呈味氨基酸[24]，包括5 种甜味氨基酸、3 种酸味氨基酸和1 种苦味氨基酸，其中甜味和苦味氨基酸的含量均有所增加，3 种酸味氨基酸中天冬氨酸和天冬酰胺含量增加、谷氨酸含量降低。在鉴定到的29 种有机酸物质中，4 种有机酸参与莽草酸途径及其下游次生代谢过程，4 种有机酸富集在三羧酸循环代谢通路上，其他大部分有机酸，包括还原糖氧化生成的糖酸、长链脂肪酸等含量有所增加。异花授粉后果实糖代谢也发生变化，蔗糖、果糖和葡萄糖3种主要糖分的含量下降，阿拉伯糖、甘露糖、蔗果三糖、核糖等含量有所增加。此外，在有籽果实中还发现腐胺、乙醇胺、碳二亚胺、咪唑衍生物、吡咯啉衍生物等含氮化合物含量增加。

图5 异花授粉对早香柚果实代谢通路的影响Fig.5 The changes of main metabolic pathways in cross-pollinated Zaoxiang pomelo

3 讨论

有些文旦系列柚类品种具有自交不亲和、单性结实能力强的特性，所结的无籽果实存在较为严重的果实外裂或内裂问题。前期研究发现早香柚自花授粉的无籽果实几乎全部内裂，而异花授粉的有籽果实内裂指数显著下降[22]，但受花期天气及人工授粉技术的影响，授粉受精不良、果实种子数较少的果实内裂现象仍然比较严重。本研究发现，早香柚果实内裂与种子有无及多少密切相关，低于30 粒时内裂率为100%，超过80 粒时果实中心柱充实、不内裂，大部分异花授粉果实的种子数介于30 ～80 粒之间，其中内裂果实占51.4%。

有研究认为裂果与果肉、果皮生长不协调有关[9]。柚果实发育过程中果肉和果皮生长不同步进行，前期以果皮发育为主，玉环柚在7月中旬果皮厚度达到最大，此时果肉仅占总体积的3%～5%，之后果肉发育加快，果皮被压缩变薄，9月下旬果实纵向生长基本停止，而横径继续扩大导致中心柱开裂[21]。本研究发现，早香柚自花授粉果实裂瓣数多为2、3 瓣，且裂瓣多处于对称位置，表明果实纵向生长缓慢后果实横向生长拉力是果实中心柱开裂的直接原因，而在异花授粉果实中，大量饱满种子排列在中心柱周围，可缓冲果实横向生长拉力，使果实内裂率降低，这是种子在减轻果实内裂上发挥的物理性作用。

在代谢水平上，异花授粉后种子产生的激素、多胺等内源物质可调控果实生长发育过程。沙田柚异花授粉后果实中生长促进类激素和多胺含量显著增加[25-26]，本研究利用GC-MS 非靶向代谢组方法未检测到内源激素，但发现异花授粉果实中腐胺含量增加。大量研究表明，多胺可促进幼果细胞分裂，与果实膨大密切相关[27]。本研究结果表明，早香柚异花授粉后果实内裂率降低，除种子起到保护中心柱的物理性作用外，可能还与多胺促进细胞分裂使中心柱发育充实有关。

前人研究表明，异花授粉后果实中可溶性糖、有机酸、油脂、蛋白、维生素、挥发性物质以及木质素等物质的含量及组分发生变化，直接影响果实内在品质[19，28-29]。本研究中，早香柚异花授粉后汁胞中可溶性糖、有机酸和氨基酸含量均发生变化，这些物质含量的变化不仅直接影响果实风味，还能作为渗透调节物质参与果肉汁胞发育，这些渗透调节物质的含量变化可能与果实膨大和内裂有关。除初级代谢外，异花授粉产生的大量种子中还含有多种次生代谢物质，包括类柠檬苦素、生物碱、酚酸、类黄酮等[30-31]，这些生物活性物质的合成大多与莽草酸代谢途径有关。本研究发现，早香柚异花授粉后果实中莽草酸、芥子酸、奎宁酸和苯甲酸含量降低，表明异花授粉后果实中莽草酸途径及其下游的次生代谢发生变化，但这些代谢变化与果实内裂及果实品质形成的关系还有待进一步研究。

4 结论

本研究发现，早香柚果实内裂与种子有无及多少密切相关；果实纵向生长缓慢后，果实横向生长拉力是中心柱开裂的直接原因；异花授粉后，种子不仅具有保护中心柱的物理作用，还可通过激素、多胺等内源物质调控汁胞可溶性糖、有机酸、氨基酸以及莽草酸途径及其下游次生代谢过程，使果实在外观和风味性状上表现明显的花粉直感效应，其中渗透调节物质的含量变化可能与果实膨大和内裂有关。本研究为异花授粉在柚生产中的合理应用以及进一步研究柚果实内裂调控机制奠定了基础。