诊断超声波联合超声造影剂提高脑肿瘤化疗疗效的实验研究

付赤学 邓劲松 李秋颖

1武警重庆总队医院医学影像科（重庆400061）；2武警广东省总队医院医学影像科（广州510507）；3武警吉林省总队医院医学影像科（长春130000）

尽管肿瘤化疗药物不断推陈出新，但是，近几年脑肿瘤的化疗效果仍然不令人满意，其原因可能是血脑屏障及血肿瘤屏障（blood⁃tumor barrier，BTB）影响大分子药物到达脑肿瘤中的浓度。许多药物在体外实验显示出治疗脑肿瘤的巨大潜力，但是由于BTB 的影响，临床实验并没有获得预期效果。传统采用渗透性破坏和辐射诱导的方法可以提高BTB 的通透性。但是，这些传统的方法在促使BTB 通透性增加的同时，非选择性的增加了血脑屏障的通透性，这既增加了药物的用量又增加了药物的毒副作用。有学者用低频超声和低功率聚集超声进行了开放大鼠脑胶质瘤BTB 的研究并取得了一定的效果［1］，但是需要专门的设备。而诊断超声是否能取得类似的效果以及对于更大动物是否有效未见报道。前期研究发现诊断超声联合微泡超声造影剂能够选择性促进血脑屏障的通透性增加［2］，其主要机理与血脑屏障的紧密连接开放有关，BTB 与血脑屏障都具有紧密连接，紧密连接是影响药物通透性的重要组织结构基础。因此，本研究利用超声激发微泡产生的生物学效应，选择性增加BTB 的通透性，提高肿瘤局部紫杉醇的含量，从而在不增加紫杉醇用量的前提下，提高脑肿瘤的化疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验动物20 只新西兰大白兔，清洁级，由陆军军医大学新桥医院动物实验室提供，雌雄不限，体重（2.45±0.23）kg。荷VX2 肿瘤种兔由重庆医科大学超声工程研究所提供。

1.1.2 超声诊断仪兔脑肿瘤超声二维及造影检查采用LOGIQ E9，12 L 探头，频率7.0 MHz，MI 0.13。肿瘤治疗采用Sequoia 512，3V2c 探头，频率1.75 MHz，输出强度MI 1.9，超声波以间断触发方式辐照兔脑，触发间隔时间为400 ms。

1.1.3 微泡超声造影剂“脂氟显”由陆军军医大学新桥医院全军超声中心自制并提供，粒径范围为1 ～5 μm，主要为1 ～2 μm，微泡的浓度为（5 ～7）×109mL。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组将瘤龄14 d 的荷瘤新西兰大白兔20 只随机分为4 组，每组5 只。即对照组（记为CON）；单纯药物组（记为PTX）；超声+药物组（US+PTX）；超声+微泡+药物组（记为US+PTX+MB）。1.2.2 兔脑肿瘤模型参照《兔脑种植VX2 肿瘤动物模型的建立》建立兔脑肿瘤模型。首先，将肿瘤兔用速眠新麻醉，肿瘤及周边脱毛，常规消毒，取鱼肉样肿瘤组织置于盛有适量生理盐水的烧杯内，用手术外科剪将肿瘤组织剪成大小约1.5 mm× 1.5 mm × 1.5 mm 的组织颗粒备用。然后，常规麻醉、脱毛、消毒后，在距颅骨矢状线和冠状线各1 cm 处钻孔开颅，去除兔顶骨约2 cm×2 cm，骨蜡止血，于骨窗中央切开硬脑膜，实验分组与方法：于脑皮质深约2 mm ，植入备用VX2 瘤块1 枚包埋，明胶海绵少许止血后缝合硬脑膜、头皮，并再次消毒。肌肉注射适量青霉素，送入动物房，常规喂养14 d，经超声检查确认模型成功，备用。

1.2.3 动物模型的评价对瘤龄14 d 的载瘤兔全部施行常规超声检查，观察脑肿瘤的大小、形态、血供等，测量肿瘤的长（L）、宽（D）、高（H），根据公式（L × D × H × ∏/6）计算出肿瘤的体积，记为TV，并进行方差分析，判定治疗前各组实验兔肿瘤组织体积差异是否具有统计学意义。所有实验兔均进行超声造影，观察动脉增强期VX2 兔脑肿瘤是否存在坏死区域，如有肿瘤坏死排除于实验组。

1.2.4 紫杉醇注射液的制备常温下将紫杉醇纯品溶解于适量的三醋酸甘油酯中，高效液相色谱法检测紫杉醇溶液的浓度。

1.2.5 治疗过程CON 组不进行任何治疗；PTX组经兔耳缘静脉9 min 内匀速注入紫杉醇溶液（3 mg/kg）；US+PTX 组经兔耳缘静脉9 min 内匀速注入紫杉醇溶液（3 mg/kg），同时诊断超声波辐照兔脑肿瘤10 min；PTX + MB + US 组经兔耳缘静脉9 min 内匀速注入紫杉醇溶液（3 mg/kg）及微泡超声造影剂（0.02 mL/kg），同时用诊断超声波辐照兔脑肿瘤10 min。总共进行7 次治疗，每天一次。最后一次治疗完成10 min 后处死实验兔。完整取出肿瘤组织称重，取约1/10 肿瘤组织精确称量、冰冻经高效液相色谱测量各种肿瘤组织中紫杉醇的含量。剩余部分福尔马林固定，24 h 后石蜡包埋、切片、HE 染色，光学生物显微镜下观察组织病理学变化。

1.2.6 疗效评价治疗后通过测量各组肿瘤质量（TM）、计算抑瘤率（TIR）以及肿瘤细胞凋亡指数评价疗效。肿瘤抑瘤率=（对照组肿瘤平均质量⁃实验组肿瘤平均质量）/对照组平均质量×100%。凋亡指数（apoptotic index，AI）的观察：采用位末端标记（TUNEL）法检测肿瘤细胞凋亡。光学显微镜下观察染色切片，于400 倍视野下随机选取5 个肿瘤细胞区，记数细胞总数和凋亡细胞数，计算TUNEL 染色阳性细胞的百分率。AI=（凋亡细胞数/肿瘤细胞总数）×100%。

1.3 统计学方法采用SPSS 13.0 软件，各组数据采用均数±标准差表示，采用方差分析和独立样本t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功建立VX2 脑肿瘤模型超声检查发现瘤龄14 d 的VX2 兔脑肿瘤相较于正常脑组织呈均匀高回声，边界清晰（图1A），CDFI：内部未见确认的血流信号（图1B）。经耳缘静脉团注0.05 mL/kg超声造影剂，可见肿瘤区迅速均匀强化，没有无增强区域（图1C）。治疗前各实验组脑组织的体积差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 各组脑肿瘤区紫杉醇的浓度US+MB+PTX组脑肿瘤中紫杉醇的含量明显高于US + PTX 组、PTX 组及CON 组，差异有统计学意义（P< 0.05）。各组脑肿瘤中紫杉醇的含量见图2。

2.3 各组治疗后的质量、抑瘤率治疗后US +MB + PTX 组体积明显小于其他各组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.4 各组经治疗后靶区肿瘤细胞凋亡TUNEL法检测，靶区肿瘤组织凋亡细胞中有棕黄色颗粒，可见肿瘤细胞固缩、核碎裂、固缩、染色质脱落、形成凋亡小体（图3）。超声＋载药微泡组靶区肿瘤细胞凋亡最明显，其凋亡指数（AI）最高，与其余各组比较差异具有显著的统计学意义（P< 0.01），见图4。

图1 瘤龄14 d 的VX2 兔脑肿瘤Fig.1 VX2 rabbit brain tumor at 14 d

图2 各处理组脑肿瘤区紫杉醇的浓度Fig.2 Concentrations of paclitaxel in brain tumor areas of each treatment group

图3 肿瘤细胞凋亡（×400）Fig.3 Apoptosis of tumor cells（×400）

表1 各组治疗后的质量、抑瘤率Tab.1 Quality and tumor inhibition rate after treatment in each group ±s

表1 各组治疗后的质量、抑瘤率Tab.1 Quality and tumor inhibition rate after treatment in each group ±s

注：US+MB+PTX 肿瘤质量与各组比较#P<0.05，*P<0.01

分组US+MB+PTX US+PTX PTX CON肿瘤质量（mg）516±108.7 697.7±136.2#724.1±131.7*912.0±172.6*抑瘤率（%）34.7±1.4 23.5±1.5 20.6±0.9

图4 各组经治疗后靶区肿瘤细胞凋亡指数（AI）Fig.4 Apoptosis index（AI）of target tumor cells in each group after treatment

3 讨论

中枢神经系统肿瘤80%都是转移性肿瘤，大多发现的时候已是晚期，手术切除的可能性很低，因此化疗显得尤其重要。然而，目前脑肿瘤的化疗效果并不令人满意。尽管一些广谱抗癌药如紫杉醇、阿霉素等在颅外肿瘤治疗中表现良好［3-4］，但是对脑肿瘤的化疗效果不明显，这可能和BTB阻碍大分子药物通过有关。为克服BTB 对化疗药物通过的阻碍，国内外专家分别通过细胞旁途径和跨细胞途径进行了一系列的探索［5］。经颈动脉灌注高渗溶液和作用于血管的缓激肽增加BTB 的通透性，但是持续时间短，而不断重复给药，又会引起颅内压的增高，甚至破坏脑脊液内环境的稳定［6-7］。有学者尝试通过影响紧密连接相关蛋白的表达提高紧密连接通透性［8-9］。超声波辐照组织细胞会产生一定的生物学效应，宋阳等［10-13］研究发现1 MHz，12 mw 的低功率超声辐照小鼠肿瘤20 s，能抑制caveolin⁃1 的表达，调高occludin 的表达，跨内皮电阻增高，提示紧密连接的通透性增加，选择性开放BTB，可持续12 h 之久。也有研究者用低频低强度聚焦超声（20 kHz ～1 MHz）进行了类似研究［14-16］，发现低功率聚焦超声联合小剂量缓激肽可上调caveolea 结构蛋白caveolin⁃1 的表达水平，增加吞饮小泡的数量，使紧密连接相关蛋白claudin⁃5、occludin 和ZO⁃1 的表达显著减少，增加BTB 的通透性。超声对BTB 的影响具有良好的应用前景，但是无论是低功率超声或是低功率聚焦超声都需要专门制备相应的设备，不利于推广应用。因此，本课题在前期研究诊断超声波能够促进血脑屏障通透性增加的基础上，进行了诊断超声波激发微泡超声造影剂对BTB 通透性影响的研究。尝试在不引起广泛血脑屏障开放的前提下，选择性地提高大分子药物紫杉醇跨BTB 转运水平，以提高脑肿瘤中紫杉醇的浓度。结果发现经超声激发微泡作用肿瘤组织组，紫杉醇的浓度达到（3.86 ± 0.21）μg/g，较对照组差异具有统计学意义。这可能与以下增强超声生物效应的措施有关：（1）超声辐照时间长，达到10 min，超声与微泡协同的生物效应与超声辐照时间成正相关。（2）采用间断触发（⊿t= 400 ms）的方式辐照肿瘤组织，靶区微泡浓度持续聚集，形成微泡局部高浓度。在一定浓度范围内，微泡浓度与生物效应成正相关。（3）采用持续静脉输注微泡的方式，与传统团注超声造影剂比较，肝脾等脏器潴留的微泡数量明显减少，有利于血池中持续存在一定浓度的微泡，有利于超声激发微泡持续作用BTB，从而促使BTB 的通透性进一步加大。第四，超声能量较高，MI 1.9，诊断目的的超声造影MI 设置为0.15 左右。随着超声能量的增加，生物效应更明显［17］。但是所有这些增强超声生物效应的措施可能会出现安全性问题，尽管在后续治疗中没有发现肿瘤兔出现即刻的神经症状，但是否有辐照区域周围的脑组织水肿，甚至少量的出血，有待进行更深入的安全性研究。

有关肿瘤组织疗效评价，观察了细胞凋亡情况。凋亡是由相关基因调控完成的一种生理现象，贯穿于机体生长、发育和死亡的整个过程。而肿瘤细胞的一个最显著的特性就是出现了凋亡功能的失调和无限增殖。近年来选择性地诱导肿瘤细胞凋亡也已成为恶性肿瘤生物治疗的新策略［18］。实验中发现通过超声联合载紫杉醇微泡靶向释放于肿瘤组织内，引起靶区肿瘤细胞的凋亡指数明显高于单纯静脉给药组及不用紫杉醇治疗的空白对照组，促进细胞凋亡作用显著。前期研究发现诊断超声辐照超声造影剂能够激发微泡的产生空化效应及声孔效应［19］，促进血脑屏障及BTB的通透性增加，从而提高靶区紫杉醇的含量。而紫杉醇通过促进微管的形成抑制其解聚，影响微管在有丝分裂中的正常功能，包括有丝分裂过程中染色体的移动、细胞形成的调控、激素分泌、细胞膜上受体的固定等。紫杉醇通过促进微管蛋白装配成微管，然后抑制微管的解聚而稳定微管，从而导致微管的异常排列，形成许多短微管束，这些微管束不与微管组织中心相连，微管彼此呈平行排列，与浆膜平行或垂直，在胞浆中出现许多均匀分布的星丝结构。微管星丝是从一个中心放射发出的，中心内并不含有中心粒，星丝也没有与染色体连结。微管的异常，使纺锤体失去正常功能，导致细胞死亡。该类药物可以在缺少鸟苷三磷酸与微管相关蛋白的条件下诱导形成无功能的微管，使微管不能解聚。紫杉醇为细胞周期特异性药物，主要作用于G2 晚期和M 期，影响细胞有丝分裂，促进肿瘤细胞凋亡。微泡作为一种靶向治疗的载体破坏后释放的药物能够进入细胞内、血管壁甚至组织间隙，增强药物在局部组织的高浓度释放，由于瘤区局部紫杉醇的含量增高，因此肿瘤细胞凋亡更明显，从而发挥靶向治疗作用［20］。

超声激发微泡使BTB 通透性增加的机理可能是多方面的。通过前期对大鼠及兔血脑屏障的研究发现，超声激发微泡能够产生声孔效应，空化产生的微射流可能提高血管内皮细胞的通透性，超声激发微泡产生共振，从而激发空化效应，这可能促使肿瘤血管的紧密连接开放，以细胞旁路方式［21-22］，从而增加紫杉醇进入肿瘤组织的通道，达到提高肿瘤组织中药物浓度的目的。当然，血肿瘤屏障除了机械屏障而外，还有电化学屏障［23］。因此，是否引起了血肿瘤屏障的电阻抗改变，是否像低频超声一样引起血管内皮细胞的胞饮小体的增加都值得进一步系统研究。

研究表明，诊断超声联合微泡组肿瘤的抑瘤率明显高于对照组，初步显示了其良好的应用前景，是一种有前途的临床肿瘤治疗技术。随着各种兼具诊断治疗双重作用的超声探头的研制，以及对超声生物学效应的深入研究，微泡介导肿瘤靶向治疗将为临床肿瘤的治疗带来新的希望。