miR⁃5088⁃5p在子痫前期患者胎盘组织中的表达及其对滋养细胞自噬的影响

殷荷 王艳华 吴琪瑞 张辉 高丽娜 朱亚飞 张慧萍，吴凯 姜怡邓

宁夏医科大学1临床医学院，2基础医学院（银川750004）；3宁夏医科大学总医院（银川750004）；4国家卫生健康委代谢性心血管疾病研究重点实验室（银川750004）；5宁夏血管损伤与修复研究重点实验室（银川750004）

子痫前期（preeclampsia，PE）是一种妊娠期女性出现的高血压、蛋白尿等多种症状并存的母婴共患疾病，严重威胁母婴健康，其发病机制至今仍不明确且尚无有效的防治措施［1］。因此，探索PE 的发病机制及新的防治手段成为产科医务工作者面临的新难题。自噬是一种进化上保守的机制，用来维持细胞的动态平衡［2］。目前，自噬在肿瘤、退行性疾病和心血管疾病的发生发展中备受关注［3］；近年来，自噬在PE 过程中的作用也逐渐受到重视［4］。研究［5］证实，胎盘滋养细胞自噬水平的异常与多种妊娠并发症有关，如PE、胎儿生长受限、早产和流产等。然而，其具体作用机制尚不明确，有待进一步研究。microRNA（miRNA）是指能够负调控基因表达的单链非编码小分子，在多种疾病中起着重要作用［6-7］。许多研究［8］证实，PE 患者存在多种miRNA 的差异表达，到目前为止，只有少数miRNA的作用被证实。其中，miR⁃5088⁃5p 在PE 发生、发展过程中的作用未见报道，仍需进一步探讨。因此，本研究以胎盘组织和滋养细胞为研究对象，检测miR⁃5088⁃5p 在PE 患者胎盘组织中的表达及在PE 诊断中的临床价值；同时，体外缺氧诱导滋养细胞发生自噬，模拟PE 发生发展的病理环境，通过过表达miR⁃5088⁃5p，检测自噬相关蛋白的变化，从而揭示miR⁃5088⁃5p 在PE 发病过程中的作用机制，为PE 的早期诊断及治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 材料HTR⁃8/SVneo 人源胎盘滋养细胞株（上海，瑞鹿）；胎牛血清、RPMI⁃1640 培养基（美国，Gibco）；青链霉素、胰蛋白酶消化液（北京，solarbio）；miR⁃5088⁃5p mimics 及miR⁃5088⁃5p NC（上海，吉码）；总蛋白提取试剂盒（上海，贝博）；LC3B 兔抗人一抗（美国CST 公司，2775）；p62 兔抗人一抗（美国abcam 公司，ab109012）；β⁃actin（美国Santa，sc⁃47778HRP）；CK⁃7鼠抗人一抗（美国abcam公司，ab9021）；总RNA提取试剂盒（北京，天根）；逆转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒（日本，Takara）；miR⁃5088⁃5p、U6 引物（广州，锐博）。

1.2 方法

1.2.1 研究对象及组织标本选取2013年1月至2015年2月在宁夏国龙妇产医院分娩的PE 孕妇25 例（PE 组），同期健康妊娠分娩的孕妇25 例（PC 组）。纳入标准：妊娠20 周后出现收缩压≥140 mmHg 和/或舒张压≥90 mmHg，同时伴有蛋白尿（尿蛋白≥0.3 g/24 h 或尿蛋白肌酐比值≥0.3 或随机尿检≥+），且无消耗性疾病。组织标本收集前征得所有孕产妇同意并签署知情同意书，本实验经宁夏医科大学伦理委员会审查批准。

1.2.2 qRT⁃PCR 检测胎盘组织miR⁃5088⁃5p 的表达根据总RNA 提取试剂盒说明书提取PE 组和PC 组胎盘组织的总RNA，取1 μg 逆转录为cDNA。通过荧光定量PCR 仪进行扩增，总体系为20 μL，以U6 作为内参，检测miR⁃5088⁃5p 的表达。PCR扩增程序：采用两步法，95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，共45 个循环；熔解曲线95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。使用2⁃ΔΔCt法统计基因的相对表达量，ΔΔCt=［Ct miR⁃5088⁃5p（待测样本）-Ct U6（待测样本）-［Ct miR⁃5088⁃5p（校正样本）-Ct U6 校正样本）］。

1.2.3 免疫荧光检测胎盘组织LC3B 及p62 的表达胎盘组织按照常规方法制备蜡块，石蜡切片厚度4 μm。石蜡切片脱蜡至水，用枸橼酸溶液高温修复抗原，恢复至室温后，PBS 洗5 min×3 次；3%H2O2室温孵育30 min，灭活内源性酶，PBS洗5 min×3次；0.5%TritionX⁃100室温孵育8 min，PBS洗5 min×3次；山羊血清室温孵育60 min，弃去血清，分别将稀释后的CK⁃7 一抗与LC3B 或p62 一抗混合，均匀滴加于切片，4 ℃孵育过夜；PBS洗5 min×3次；加入荧光二抗，室温避光孵育2 h，PBS洗5 min×3次；DAPI染细胞核，PBS洗5 min×3次后，滴加抗荧光猝灭剂封片，快速于激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.4 细胞培养HTR⁃8/SVneo 细胞接种于25 cm2的细胞培养瓶中，给予含10%胎牛血清、100 μg/mL青链霉素的RPMI⁃1640 培养基5 mL，置于37 ℃、5 % CO2培养箱内培养。每2 ～3 d 用0.25 %胰蛋白酶消化传代1 次，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.5 细胞转染及分组待培养瓶中细胞密度达60%～70%时，严格按Lipofectamine2000 说明书进行转染操作，将miR⁃5088⁃5p mimics 及miR⁃5088⁃5p NC 分别转染至HTR8/Svneo 细胞，各分为2 组进行培养：正常组（nomorxia）：在37 ℃、5%CO2的条件下培养；缺氧组（hypoxia）：在NAPCO Series 8000WJ培养箱中以37 ℃、1%O2和5%CO2的条件下培养。另外设立空白对照组（未进行转染操作的自然生长HTR8/Svneo 细胞），各组均重复三次。

1.2.6 Western blot测定LC3B和p62蛋白表达收集各组滋养细胞后提取总蛋白；取30 μg 蛋白样品于12 %分离胶和4 %浓缩胶进行SDS⁃PAGE 电泳；将蛋白质湿转至PVDF 膜；用5 %脱脂牛奶封闭2 h；加入一抗4 ℃孵育过夜；PBST 洗涤10 min×3 次；加入HRP 标记的二抗（均1∶5 000），室温孵育2 h；PBST 洗涤10 min×3 次；ECL 化学发光显色，分别以LC3BⅡ/Ⅰ灰度值比值作为LC3B 蛋白的表达量，p62 灰度值与内参β⁃actin 灰度值比值作为p62 蛋白的表达量，实验重复3 次。

1.2.7 统计学方法用Prism 6.0 统计软件进行统计学分析，结果以均数±标准差表示，计量资料两组对比采用t检验，多样本均数间比较采用One⁃way ANOVA 检验，相关性分析以pearson 相关系数表示，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象临床资料的分析与PC 组比较，PE 组年龄差异无统计学意义（P> 0.05），而孕周、收缩压、舒张压、血小板计数及新生儿体重差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 研究对象临床资料分析Tab.1 Analysis of clinical data of study subjects±s

表1 研究对象临床资料分析Tab.1 Analysis of clinical data of study subjects±s

年龄（岁）孕周（周）收缩压（mmHg）舒张压（mmHg）血小板计数（×109/L）新生儿体重（g）PC（n=25）27.80±0.94 39.60±0.19 115.20±1.54 74.80±1.31 181.44±7.79 3 414.00±95.02 PE（n=25）26.28±0.92 38.44±0.43 145.20±2.89 97.00±1.47 207.12±11.36 3 114.00±165.49 P 值0.2533 0.0151<0.001<0.001 0.0228 0.0126

2.2 miR⁃5088⁃5p 在胎盘组织中的表达通过qRT⁃PCR 检测胎盘组织中miR⁃5088⁃5p 表达水平发现，与PC 组比较，PE 组胎盘组织中miR⁃5088⁃5p表达明显下调（P< 0.01），提示miR⁃5088⁃5p 可能在PE 发生过程中发挥重要作用，见图1。

图1 qRT⁃PCR 检测胎盘组织miR⁃5088⁃5p 的表达Fig.1 qRT⁃PCR detection of miR⁃5088⁃5p expression in placenta

2.3 miR⁃5088⁃5p 表达水平与研究对象临床特征的相关性分析为了初步探讨miR⁃5088⁃5p 与PE的关系，进行pearson 相关性分析（见图2）。miR⁃5088⁃5p 的表达水平与收缩压（r=-0.5 758）、舒张压（r=-0.6 125）和血小板计数（r=-0.6 082）均呈负相关（P< 0.05）；相反，与新生儿体重呈正相关（r= 0.6 458），差异均有统计学意义（P< 0.05），进一步证实miR⁃5088⁃5p 在PE 发生发展中的重要作用。

图2 miR⁃5088⁃5p 的表达水平与临床特征的相关性分析Fig.2 Correlation analysis between the expression level of miR⁃5088⁃5p and clinical features

2.4 胎盘组织及胎盘滋养细胞中LC3B 和p62 蛋白的表达胎盘组织免疫荧光结果显示：与PC 组比较，PE 组LC3B 蛋白表达明显增加，而p62 蛋白表达减少；同时，体外缺氧干预滋养细胞48 h后，与Nomorxia 组比较，Hypoxia 组胎盘滋养细胞LC3BⅡ/Ⅰ表达增加（P<0.05），而p62 蛋白表达降低（P< 0.05），与组织水平一致，提示在PE 的发病过程中伴随着自噬的发生，而体外缺氧干预滋养细胞可以模拟PE 发生自噬的病理过程，见图3。

2.5 过表达miR⁃5088⁃5p后胎盘滋养细胞自噬的改变为进一步探讨miR⁃5088⁃5p的作用，将miR⁃5088⁃5p mimics 转染胎盘滋养细胞，同时分为Nomorxia组和Hypoxia 组，培养48 h 后应用Western blot 检测各组细胞LC3B 和p62 蛋白的表达。结果显示：在Nomorxia 组中，转染miR⁃5088⁃5p mimics 后的胎盘滋养细胞LC3BⅡ/Ⅰ表达降低（P<0.001），p62蛋白表达增加（P<0.05），自噬水平降低；同时，Hypoxia组中亦发现相同的自噬水平变化，提示miR⁃5088⁃5p可抑制缺氧所致的胎盘滋养细胞发生自噬，从而抑制PE的发生发展，见图4。

3 讨论

图3 胎盘组织及胎盘滋养细胞中LC3B 和p62 蛋白的表达Fig.3 Expression of LC3B and p62 proteins in placental tissues and placental trophoblasts

图4 miR⁃5088⁃5p 过表达后检测其自身和LC3B、p62 蛋白的表达Fig.4 Detection of miR⁃5088⁃5p and LC3B，p62 protein expression after overexpression miR⁃5088⁃5p

近年来，PE 的发病率和病死率逐年上升［9-10］。然而，PE 的发病机制至今仍不明确。胎盘是母体与胎儿间进行营养物质交换的特有器官，临床资料显示，随着胎儿和胎盘的娩出，PE 的临床症状可迅速恢复正常，可见，胎盘在PE 的发生发展中起着重要作用［11-12］。滋养细胞是胎盘的主要功能细胞，是妊娠维持和稳定的基础［9］。研究［13］证实，胎盘滋养细胞功能异常与PE 的发展过程密切相关。

自噬广泛存在于真核细胞中，参与多种细胞的生理病理过程，受多种分子机制调控［14］。研究［15］证实，自噬可在受精、胎盘形成和分娩多个过程中影响妊娠的发生和维持，但目前关于自噬调节PE 发病的具体机制尚不清楚。因此，本研究为了探讨自噬在PE 发生发展中的作用，将CK⁃7 分别与LC3B 和p62 共同定位，胎盘组织免疫荧光检测发现LC3B 在滋养细胞中的表达增加，而p62 表达减少；同时，通过体外缺氧刺激胎盘滋养细胞，模拟PE 发生微环境，发现与Nomorxia 组比较，Hypox⁃ia 组胎盘滋养细胞LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达增加，而p62 蛋白表达降低，与PE 胎盘组织中自噬水平变化一致，提示自噬参与了PE 的病理过程，但具体调控机制仍需要进一步研究。

miRNA 是长约22 nt 的小非编码RNA，在转录后水平调节基因的表达变化［16］。同时，miRNA 参与调节各种生理病理过程中的不同信号通路，受到学者的广泛关注［17］。研究［18-19］表明，孕妇在怀孕期间，受心血管并发症的影响，各种循环miRNA表达异常。研究［20］发现，miR⁃133b 在PE 中表达下调，可通过抑制SGK1 促进滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭，进而参与PE 的发生发展；提示miRNA可能通过影响滋养细胞的增殖、凋亡、自噬、侵袭和迁移等生物学行为，推动PE 的发生与发展［21］。课题组［22］前期也已发现miR⁃5088⁃5p 在缺氧诱导的滋养细胞中表达降低，但是其在PE 中的具体作用仍不清楚。因此，本研究首先通过qRT⁃PCR 在25 例PC 组和25 例PE 组胎盘组织中检测miR⁃5088⁃5p 的表达，发现miR⁃5088⁃5p 在PE 中明显下调，提示miR⁃5088⁃5p 可能在PE 发生过程中发挥重要作用，与以往文献得出的结论一致；然后，分别将miR⁃5088⁃5p 的表达水平与PC 组及PE 组临床特征进行相关性分析，发现miR⁃5088⁃5p 与收缩压、舒张压及血小板计数呈负相关，与新生儿体重呈正相关，说明miR⁃5088⁃5p 的异常表达与PE 密切相关。同时，为进一步探讨miR⁃5088⁃5p 在PE 自噬中的作用，体外将miR⁃5088⁃5p mimics 转染滋养细胞，缺氧培养48 h 后，发现过表达miR⁃5088⁃5p 后，LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达降低，p62 蛋白表达增高，自噬水平明显降低。表明miR⁃5088⁃5p可以抑制胎盘滋养细胞自噬发生。在PE缺氧模型中转染miR⁃5088⁃5p mimics，发现自噬过程同样被抑制。这些研究结果提示miR⁃5088⁃5p 可以抑制胎盘滋养细胞自噬发生，从而抑制PE 的发生发展。但是，由于标本数量有限，少量的样本尚不能代表全部的临床病例，因此，后续将扩大样本数量进一步验证，并在血清中探索miR⁃5088⁃5p 在PE 疾病中的诊断价值。

综上所述，研究结果表明miR⁃5088⁃5p 在PE中表达降低，并与PE 的临床特征密切相关，可作为一种保护性因子，抑制PE 胎盘滋养细胞自噬的发生，延缓PE 的发生发展。这为PE 发病机制的研究开拓了一个全新的视角，为研究人员探究PE胎盘滋养细胞自噬过程中miRNA 的调控机制提供了新的思路。并且，由于miR⁃5088⁃5p 特殊的生物学功能，它可作为调控滋养细胞自噬的关键基因，对其具体机制的进一步研究，将为临床预防及早期诊断PE 提供重要的理论依据。