超声微泡在肝癌治疗中的应用研究进展

于姣姣，查莉，曾书娥

0 引言

肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤，据最新统计，全球肝癌的发病率占所有癌症的第6位，死亡率占第4位[1]。肝癌是一种高度致命的恶性肿瘤，它的发病率与死亡率大致相当[2]。除手术外，化疗、免疫治疗及抗血管生成治疗等也是临床上常用的药物治疗方法，但各类药物的不良反应及耐药性的产生也是临床亟待解决的问题。近年来，随着分子生物学和基因技术的发展，应用超声微泡介导肝癌的靶向治疗成为研究的热点，并有望为肝癌患者提供一种更安全、有效的治疗方法。本文将对超声微泡在肝癌治疗中的应用研究综述如下。

1 超声微泡

常见的超声微泡一般由外膜和其包裹的气体构成，外膜材料主要为脂质类、高分子材料类、蛋白类以及非离子表面活性剂类等，这些材料构成的外膜不仅能够防止气体逸出，还能阻止微泡间的相互融合。微泡包裹的气体主要为高分子气体或惰性气体（如氟碳气体等），稳定的气体核心，不仅具有更好的超声散射和反射效果，同时也能安全的从肺内排出，消除体内残留的隐患。传统微泡粒径通常在1～8 μm，在超声波激发下，能够增强组织回声，提高组织显影。目前还有纳米级的微泡[3-4]，是一种含纳米级别气泡的混悬液，如液态氟碳微泡，它不仅具备粒径小、稳定性好、循环时间更长的特点，而且有无毒性、生物相容性好等诸多优势，还可以用作靶向分子探针[5]。纳米微泡作为药物或基因的载体，较微米级微泡具有更强的穿透力，能透过血管内皮间隙，渗入到肿瘤的空隙中，能够在体内存在足够长的循环时间；纳米微泡表面更容易被修饰，从而有效地聚集到肿瘤中，对病变部位表现出更强的靶向能力，减少对周围正常组织的损伤，增强治疗的效果[6-7]。目前临床上使用的微泡造影剂主要为微米级，能自由通过肺循环，但不能穿透血管内皮，主要用于显影来诊断肿瘤等疾病。纳米微泡是目前超声微泡发展的研究热点。

2 超声微泡介导基因或药物的治疗机制

超声微泡载基因或药物的方式主要有以下几种[8]：（1）附着于微泡表面；（2）包裹于微泡内部；（3）直接成为微泡的外膜材料之一；（4）嵌入双分子层的微泡内外膜之中；（5）利用静电的相互作用，被非供价结合至微泡表面。携带药物或基因的超声微泡到达靶组织或靶器官后，在一定强度超声的辐照下，微泡可以发生破裂，从而产生一定的微射流、切应力和冲击波，使相应的细胞膜通透性增强，其内皮细胞的间隙增大，基因或药物从间隙进入，到达指定的部位，来实现靶向治疗的目的。在一定强度的超声辐照下，微泡作为一种空化核，它可以不断振动、膨胀、压缩，甚至破裂，从而产生空化效应和机械效应，二者均能使细胞膜的通透性增强，尤以空化效应为主。空化效应主要分为两种：第一种是稳态空化：在低强度超声的作用下，引发的辐射压和微射流也较小，对细胞或组织产生特定的生物学效应；第二种是瞬时空化：在高强度超声的作用下，能够达到瞬时空化的阈值，从而产生高速的微射流、巨大的切应力以及高能效冲击波，使细胞膜的通透性增强、内皮细胞的间隙增大以及微血管发生破裂，这有利于药物的吸收以及基因的转染，最终引起肿瘤细胞发生凋亡坏死。有学者研究表明[9]，在基因转染中起到主要作用的是超声的瞬时空化效应，同时产生的微射流、切应力以及冲击波，可在细胞膜上形成可逆或不可逆的小孔，让外源基因从小孔进入到细胞，上述现象称为声孔效应，这种声孔效应正是药物或基因突破细胞膜的屏障进入细胞内的重要环节，也是超声微泡增强基因的转染与表达十分重要的原因。

除了上述机制外，曾也有学者表明[10]，超声辐照之后，外源基因的表达会增高，与细胞损伤修复相关的基因表达也增高了，由此可见，与细胞损伤修复相关的基因表达，有可能是外源基因转染的机制之一。和机械损伤后膜的修复动力学以及囊泡的胞吐作用相似，从而成为外源基因的输送途径，提高转染率。Meijering等[11]研究发现，超声辐照微泡破裂后，可以产生活性氧（H2O2），让邻近细胞膜Ca2+内流，使细胞膜的通透性增加，从而诱导外源性分子（如携带基因或药物的微泡）进入细胞内发挥作用。

3 超声微泡在肝癌治疗中的应用

3.1 超声微泡靶向传递化疗药物

化疗在肝癌的治疗中起着重要作用，但化疗药物在肿瘤部位的药物利用率较低、耐药性的产生以及对正常组织的毒副作用等，一直是临床面临的难题。众多研究数据表明，超声微泡不仅能增强肿瘤病灶的显像，还能作为一种新型载体，对基因和药物进行靶向传递，并在局部释放，达到治疗疾病的目的[12-15]。杨健等[16]采用机械振荡法和生物素-亲和素连接法制备了DR5靶向载多烯紫杉醇微泡，联合超声靶向微泡破裂技术通过下调Βcl-2和NF-κΒ表达、上调Caspase-8和DR5表达，从而增强了对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制、诱导细胞凋亡以及阻滞细胞周期的能力，相对于仅使用多烯紫杉醇药物，DR5靶向载多烯紫杉醇微泡组抗肿瘤作用明显增强。常瑞姣等[17]在体内实验中发现，超声辐照载多西紫杉醇微泡，能够对人高转移肝癌细胞MHCC97-H荷瘤裸鼠的肿瘤生长起到明显抗肿瘤效应，并且还能诱导肿瘤细胞的凋亡，因此认为载多西紫杉醇微泡和单独给予化疗药物治疗相比较，前者是一种更安全、能减少不良反应的给药和治疗方式。载药超声微泡治疗肝癌，主要通过增加局部药物的吸收，降低全身化疗药物的剂量，提高对化疗的耐受性，从而达到减少全身毒性的作用。其次超声介导载药微泡能够在超声辐照的肿瘤区域释放，使肿瘤内药物浓度增加，微泡破裂形成更小的纳米颗粒，积聚在肿瘤内，缓慢释放药物，从而延长药物的代谢时间。超声微泡介导化疗药物的靶向传输作为一种非侵入性方法，是增强肿瘤患者化疗效果，改善患者对化疗不良反应的新方法。

3.2 超声微泡靶向递送基因

肝癌的基因治疗，是指将外源基因引入到患者靶组织或靶细胞中进行转染并表达，以杀死肿瘤细胞，这种方法被认为是一种极其有前景的肿瘤治疗方法，也是目前现代医学发展的一种重大趋势。尽管如此，但以往研究发现，裸露的基因治疗存在许多缺点，例如：（1）容易被各种核酸酶降解；（2）基因在血液中降解较快，半衰期较短；（3）裸露的基因缺乏靶向性，细胞对其摄取率极低；（4）基因自身的负电荷和细胞膜上的负电荷能够相互排斥，从而导致其通过细胞内吞作用入胞的能力和逃逸内涵体的能力比较差。因此，要使基因治疗取得成功，关键在于安全有效的传递系统。超声微泡作为一种非病毒靶向治疗载体，在超声空化效应的作用下，使释放的基因进入到细胞内、血管壁和组织的间隙，从而促进基因的转染与表达，使之发挥靶向治疗作用[18]。Chowdhury等[19]将反义miR-21载入微泡内作用于小鼠肝癌皮下移植瘤，通过超声聚焦辐照，发现肿瘤体积显著缩小，肝癌细胞的增殖迁移以及侵袭能力降低，同时还提高了肝癌细胞对阿霉素的敏感度。朱芳方等[20]利用超声微泡介导miR-181c-shRNA转染人肝癌HepG2细胞后，miR-181c在细胞中的表达发生下调，细胞的增殖也受到抑制，细胞周期发生了阻滞，将有望为肝癌的基因治疗提供新的靶点。谭妍迪等[21]研究发现，超声介导载miR-206和sPD-1基因纳米微泡，作用于小鼠H22肝癌皮下移植瘤，不仅能够阻断PD-1与PD-L1的互相结合，还能上调干扰素-γ，下调PD-L1，解除T细胞的抑制，从而提高T细胞和自然杀伤细胞的活性，进一步增强细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤作用，并未对周围组织造成损伤，这说明超声联合微泡是一种新型非病毒转染的安全有效的基因治疗方法。

3.3 超声微泡增强肝癌治疗中经皮局部消融技术的疗效

经皮局部消融技术主要包括温度消融和化学消融两种形式。温度消融主要包括微波消融、射频消融、激光消融、高强度聚焦超声（high intensity focus ultrasound,HIFU）以及冰冻消融等；而化学消融主要包括酒精消融及醋酸消融等。有研究显示，超声靶向微泡能够改变组织中的声环境，而达到提高消融效率的目的[22]。Xiao等[23]发现超声微泡能增强兔VX2肝癌微波消融的效果，而且肝癌细胞坏死和凋亡率较其他组高，同时没有产生严重的肝功能损伤。范蕊等[24]通过小鼠实验发现，微波消融联合载阿霉素超声微泡靶向击破可提高肝癌细胞内药物浓度，抑制肿瘤增殖和微血管生成，弥补了单纯微波消融治疗适形性不足，同时降低药物对心、肾的不良反应，为降低肝癌复发提供了新的联合治疗思路。任春蓉等[25]制备了叶酸受体靶向的载10-羟基喜树碱（10-HCPT）相变纳米粒，在HIFU辐照后，能够破坏微泡，定向释放HCPT，靶向作用于裸鼠肝癌移植瘤，结果显示，该治疗组不仅消融范围变大、肝癌细胞的增殖率最低、凋亡率最高，而且肿瘤生长最为缓慢，其转移灶最少，由此发现该治疗方式对肝癌的远期疗效最好。微泡是一种高声阻抗的物质，可以增强热效应，从而提高治疗效果，HIFU联合超声微泡还可增加靶目标自由基的形成，扩大治疗的范围，减少治疗的时间。

3.4 超声微泡介导肝癌微血管栓塞的治疗

肝动脉化疗栓塞术是肝癌治疗中常用的方法之一，但现有技术只适用于中大型血管，尚难以对肝内大量微血管进行栓塞。有学者[26]研究表明，肿瘤的生长和转移与肿瘤微血管有很大关系，肝癌的大小也和微血管的分型呈正相关趋势，通过栓塞供养肿瘤的微循环以及侧枝循环，成为治疗肝癌的一个靶点。超声微泡经静脉注入，进入到微循环中，在超声辐照下，产生空化效应，可促使供应肿瘤的微血管发生破裂，诱发血管栓塞，使肿瘤坏死。仇春丽等[27]发现超声介导自制纳米微泡联合顺铂对小鼠肝癌皮下移植瘤具有协同抗肿瘤效应，且肿瘤微血管密度的表达降低，其机制可能是抑制了肿瘤微血管的生成，从而诱导细胞凋亡。Kim等[28]利用超声微泡介导载阿霉素的纳米粒联合动脉化疗栓塞在兔VX2肝癌模型中，通过抑制肝癌微血管生成，阻断供血，使肿瘤生存能力降低，肿瘤细胞发生凋亡，提高了肝癌治疗效果。因此，超声微泡介导微血管栓塞，增强肝动脉化疗栓塞，有望成为一种新的肝癌治疗方法。

4 问题与展望

超声微泡能够靶向传递化疗药物，将外源基因导入到肝癌细胞内，还能增强经皮局部消融治疗的疗效，为肝癌提供了新的治疗方法。目前大部分研究仍处于临床前阶段，由于对超声分子影像技术的研究有限，有许多实际问题尚待解决。如：超声介导微泡治疗时，有可能会发生血管内外的溶血、毛细血管破裂、心肌受损、微循环被破坏、炎性反应以及细胞死亡等并发症，超声微泡的相关声学特性还需要进一步的明确，微泡的制备方法和超声辐照参数仍然需要更进一步的优化。关于微泡载药量低，达不到临床试验所需要的剂量，如何提高载药量也是治疗中需解决的关键问题。另外，如何保证药物或基因在靶组织中能够安全稳定的释放与表达，如何提高靶向微泡的靶向结合能力等，均有待在微泡材料、制备方法以及参数设置等方面深化研究。随着以上问题的攻克，超声微泡介导药物或基因在肝癌的治疗中将发挥更大的作用。