亚洲西尼罗河病毒的系统发育及E 蛋白分子进化特征分析

蓝青萍，冯凯，王晓丹，潘玥，陈俊英，孙强明

中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，云南昆明650118

西尼罗河病毒（West Nile virus，WNV）是一种单链正义RNA 病毒，属于黄病毒科黄病毒属，于1937年首次从西尼罗河乌干达省一名发热妇女的血液中分离出来，在随后的几十年里，WNV 席卷了亚洲、欧洲、非洲、北美等地区［1-3］。

WNV 是病毒性脑炎的主要病原体，在自然界中，以鸟-蚊-鸟的传播周期维持循环，主要通过蚊虫尤其是库蚊媒介进行传播［4-5］。人类感染WNV 可引起西尼罗热和WNV 性脑炎，临床症状包括无症状感染或轻度急性发热性疾病及神经系统疾病，包括脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹［6-7］。WNV 具有生物多样性，基于遗传差异，目前提出了9 个WNV谱系［3，8］，见表 1。由于目前对 WNV 感染尚无明确的治疗方法，因此开发安全有效的人用疫苗对预防WNV 感染至关重要［9-10］。不同地理位置的WNV 遗传变异可能与病毒的毒力、扩增和遗传等有关，研究发现，WNV 的 E 蛋白第 154 ～ 156 位点是糖基化位点，被认为是毒力因子，该位点的删除可降低病毒的复制［11］，因此推测该位点可作为WNV 疫苗研究的潜在靶点。

本研究分析了亚洲区来自中国、马来西亚、印度、以色列、巴基斯坦、伊朗和土耳其等WNV 流行株的进化特征、流行趋势及WNV 结构蛋白E 的核苷酸和氨基酸突变特征等，旨在为后续研究WNV的传播和感染机制及疫苗的研发提供依据。

表1 WNV 谱系概述Tab.1 Overview of WNV lineages

1 材料与方法

1.1 亚洲区WNV 流行株核酸序列获取 以“West Nile virus”为检索词在 NCBI-Pubmed 查询 WNV 的流行情况，发现在亚洲地区，WNV 于1951 在以色列首次暴发，20 世纪70 年代土耳其和伊朗也有WNV的报告［1-3］，20 世纪50 年代从印度西部和南部的蚊虫中分离出WNV 毒株，2013 年中国新疆省首次确诊WNV 的人类病例［4］。分别以“West Nile virus”、“West Nile virus China”、“West Nile virus India”、“West Nile virus Israel”、“West Nile virus Pakistan”、“West Nile virus Iran”、“West Nile virus Malaysia”、“West Nile virus Turkey”等为关键词和主题词，在NCBI 的Pubmed（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov ／pubmed ／）和 GenBank（https：／ ／ www.ncbi.nlm.nih.gov ／ nuccore ／）上进行检索，并获取亚洲区WNV流行株核苷酸序列。

1.2 亚洲区WNV 流行株的序列进化分析 选取在GenBank 中登录的 WNV 亚洲地区病毒株China（AY490240、JX442278、JX442279、JX442280、JX442-281、JX442282）、India（JQ303102、GQ851605、KU97-8770、GQ851604、KC601756、JX041632、EU249803）、Israel（HM152776、HM051416、AY688948、HM152775、HM152773、AF481864）、Pakistan（MH545365、MH54-5363、MH545364、JX070655）、Iran（MF462262、KJ48-6150）、Malaysia（MK327792、MK327802、MK327788、MK327789）、Turkey（JN828806、KJ433826、KJ958922、KP400657、KC290932、MK327808） 以及参考病毒株New York（AF196835）、Australia（D00246）、India（DQ-256376）、Uganda（AY532665）、Czech Republic（AY7-65264）、Russia（277251）、Austria（KJ831223）、Senegal（EU082200）、Senegal（KJ131502），应用 BIOEDIT 软件对上述WNV 亚洲地区病毒株核酸序列进行多重比对。利用 MEGA 6.0 软件构建病毒全长序列和部分E 蛋白序列的系统发育进化树，进化树构建参数为：最大似然法，Bootstrap 设为1 000。

1.3 E 蛋白突变分析 将亚洲地区病毒株的E 蛋白核苷酸序列进行谱系1 和谱系2 比对，分析核酸突变情况，再通过在线翻译（http：／ ／ www.bio-soft.net ／sms ／ index.html）将碱基序列翻译成氨基酸序列，分析氨基酸突变替代情况。

2 结 果

2.1 亚洲区WNV 流行株核苷酸序列的获取 经检索，获取亚洲区WNV 流行株核苷酸序列见表2。

2.2 亚洲区WNV 流行株的序列进化分析 通过GenBank 获取亚洲区WNV 流行地区中国、马来西亚、印度、以色列、巴基斯坦、伊朗和土耳其的WNV全基因组序列和部分E 蛋白基因组序列，将获取的WNV 全基因组序列与不同谱系的代表株进行系统进化树分析，见图1，可以看出，WNV 以色列株（HM152773、AF481864）在亲缘关系上与谱系 1a 株最为接近，而以色列株（AY688948）在亲缘关系上与谱系2 株较为接近，印度株（KU978770）的亲缘关系与谱系1c 接近，且分布在不同的小支上。将获取的不同谱系代表株的E 蛋白序列进行系统进化分析，发现 WNV 中国株（JX442278，JX42280-JX44-2282）在亲缘关系上与谱系1a 株最为接近，马来西亚株在亲缘关系上与伊朗株（KJ486150）接近，巴基斯坦株与印度株（JQ303102）接近，而马来西亚株和巴基斯坦株与其他谱系的WNV 株亲缘关系较远，分布在不同的两大分支上，见图2。上述亚洲区WNV流行株的序列进化分析表明，亚洲区流行的WNV 可能来源于谱系1 株与谱系2 株，且病毒可能存在位点突变。

表2 亚洲区WNV 流行株核苷酸序列Tab.2 Nucleotide sequences of WNV endemic strains in Asia

图1 根据WNV 全基因组序列构建的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on complete nucleotide sequence of WNV

图2 根据WNV E 蛋白部分序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on partial sequence of WNV E protein

2.3 WNV E 蛋白突变分析 将中国、巴基斯坦、印度、以色列和土耳其共5 株WNV 的E 蛋白与谱系1 和谱系2 WNV 代表株的E 蛋白进行核酸序列和氨基酸序列比对，发现与谱系2 株相比，WNV E 蛋白碱基突变率和氨基酸突变率整体比谱系1 高。与谱系1 相比，除印度株（KU978770）外，所有其他株 E 蛋白的碱基突变率和氨基酸突变率与谱系1a 相比最低，表明WNV 谱系1a 在亚洲区较为流行；而印度株（KU978770）与谱系 1c 株相比，其 E 蛋白碱基突变率与氨基酸突变率最低，分别为0.8%和0.4%，这与前面进化分析的结果一致，即印度株（KU978770）与谱系1c 株在亲缘关系上最为接近，见表3 和表4。将亚洲区流行的WNV 株E 蛋白与谱系1a 比对发现，印度株（GQ851605、JX041632、GQ851604 和 KU-978770）的第154 和156 位氨基酸分别由天冬酰胺突变为天冬氨酸和丝氨酸（N154D、N154S），丝氨酸突变为脯氨酸和丙氨酸（S156P、S156A），而中国株（AY490240）、巴基斯坦株（JX070655）及以色列株（HM051416）的第156 位氨基酸分别由丝氨酸突变为脯氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸（S156P、S156F、S156P），见表5，推测这些位点的改变可能与病毒的毒力、致病性、神经侵袭性、流行等有关。

表3 WNV E 蛋白碱基突变率（%）Tab.3 Base mutation rate of WNV E protein（%）

表4 WNV E 蛋白氨基酸突变率（%）Tab.4 Amino acid mutation rate of WNV E protein（%）

表5 WNV E 蛋白氨基酸突变位点分析Tab 5.Analysis of amino acid mutation sites of WNV E protein

3 讨 论

E 蛋白是病毒包膜的主要成分，位于病毒颗粒的最外层，主要参与细胞表面受体识别与结合，与病毒进入细胞以及与宿主膜融合相关。E 蛋白是WNV的主要毒力因子，一些报道认为，E 蛋白糖基化位点的突变是影响WNV 毒力改变的重要因素［11-12］。本研究将亚洲地区不同国家不同WNV 株的E 蛋白氨基酸序列与谱系1 和谱系2 相比，发现与谱系2 相比，E蛋白的碱基和氨基酸的突变率较高，表明谱系1 的病毒株在亚洲区流行广泛。E 蛋白的第154 ～156 位是WNV 谱系 1（1a 和 1b）和谱系 2 的糖基化位点，该位点被认为与病毒毒力相关，分析发现，E 蛋白的第154 和156 位氨基酸存在变异，推测可能与亚洲区流行株的毒力、致病性、神经侵袭性、流行等有关。

自1937 年在乌干达分离出WNV 以来，该病毒已在全球传播，分别分布于非洲、亚洲、欧洲和澳大利亚［2］。自 1999 年以来，WNV 的流行出现在美洲，具有较高的发病率和死亡率。2014 年，美国疾病控制与预防中心（CDC）的监测数据表明，WNV 是美国神经侵染性虫媒病毒疾病的最常见病原［13］。有文献表明，近几年WNV 在世界范围内不断扩散传播，并发现基因型为WNV02 的毒株在全球范围内的扩散效率比NY99 毒株更高，表明病毒的传播和暴发与其基因的进化显著相关［14］，因此，分析WNV 的系统发育和分子进化特征，对研究WNV 的传播流行和感染机制具有重要意义。基于系统发生的分类，目前可将WNV 分为9 个谱系，能引起人类感染的WNV主要来自谱系 1 和谱系2［15-16］，谱系 1 通常分布在非洲、欧洲、澳大利亚、亚洲、北美和中美洲及中东，谱系1a 在美国（NY99 毒株）、非洲、欧洲和中东地区分布最广，可能是引起这些地区大暴发的原因［3］；而谱系2 的WNV 早期主要在非洲大陆局部流行，后来传到了俄罗斯、匈牙利、意大利和希腊［17］。本研究将亚洲区流行株与不同谱系的代表株进行系统进化分析，发现亚洲区流行的WNV 可能来源于谱系1株和谱系2 株，且病毒可能存在进化突变。

综上所述，本研究通过对亚洲流行地区WNV的核苷酸序列和E 蛋白序列进行分析比对，构建分子进化树，比较其亲缘关系，并进一步阐述了这些病毒株间E 蛋白核苷酸和氨基酸突变情况，为后续研究WNV 的暴发流行机制提供了理论依据。