假病毒在肠道病毒相关研究中的应用

霍雅倩 综述，毛群颖，李秀玲 审校

1.上海生物制品研究所有限责任公司，上海200050；2.中国食品药品检定研究院肝炎病毒疫苗室，北京100050

肠道病毒（enterovirus，EV）属于小 RNA 病毒科肠道病毒属，是一类无包膜病毒，包括EV-A ～L 共12 个组，约 163 种病毒（https：／ ／ talk.ictvonline.org.）。EV为20 ～30 nm 的二十面体立体对称球形颗粒，由1个裸露在外的病毒蛋白衣壳和内含的一条单股正链RNA 构成，引起的重症疾病包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、心肌炎和脊髓灰质炎［1-3］等。20 世纪上半叶，脊髓灰质炎病毒曾在全球范围内流行，直至疫苗的普及和应用，有效控制了疾病流行。WHO 提出了全球消除脊髓灰质炎的倡议和目标［4］，使人类进入后脊髓灰质炎时代。自20 世纪90 年代以来，由EV71、CV-A16 等多种EV 引起的婴幼儿手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）在亚太地区出现持续大范围暴发流行，呈现出流行强度高、范围广、重症和死亡人数多的特点［5］，引起了人们高度关注。

2015 年12 月，在国家的重点支撑下，经过8 年的联合攻关，由我国自主研发的EV71 全病毒灭活疫苗获批上市。上市后我国HFMD 死亡病例持续降低，至2018 年我国HFMD 的死亡病例已较该疫苗上市前（2010—2015 年均值）下降了93%（http：／／www.nhc.gov.cn.），使我国成为全球唯一可以有效防控EV71所致HFMD 的国家。而由CV-A16、CV-A6 及CV-A10等其他EV［6］引起的HFMD 仍呈持续高流行态势，近年来由EV71 为核心的多价HFMD 疫苗的研发得到越来越多的重视［7］。相关领域的病原学、流行病学、动物模型、检测方法等相关研究均得到了快速发展。

假病毒由于可携带报告基因，且只能进行一个细胞周期的感染，具有生物安全性高、与真病毒特性相近、定量准确客观、研发速度快等优势，已被广泛应用于多种病毒的相关研究中。本文就假病毒在EV 中和抗体检测方法、抗病毒药物筛选、可视化动物模型建立等方面的研究进展作一综述。

1 假病毒的定义

假病毒是一种人工构建的不具有完整基因组的病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs），与天然病毒相比，其表达包膜蛋白或衣壳蛋白的序列被删除或被修饰，通常由报告基因代替，使其保持了天然病毒可感染宿主细胞的特性，但又不能扩增、复制，无法产生具有感染性的子代病毒颗粒，因此不会污染环境，生物安全性高，不需要在BSL-3 及以上级别实验室进行操作［8］。同时假病毒还可通过携带特定报告基因，如荧光素酶等，利用化学发光，达到对病毒客观、准确定量的目的，也可通过活体成像、定位，直观反映病毒在动物体内的动态转归［9］。近年来已越来越多地应用于病毒进入宿主细胞过程和特异性受体、中和抗体表位、假病毒疫苗、中和抗体滴度检测方法、抗病毒药物筛选、病毒基因治疗、可视化动物模型建立等研究中［10］。另外，假病毒由于其整合衣壳蛋白的能力及较高的转染效率，具有宿主范围广泛、可抵抗血清补体的灭活等作用［10］。

2 假病毒的构建

病毒的构建是假病毒研究的关键环节。以人EV、乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）为代表的非包膜病毒［11］通常使用多质粒共转染，或RNA与质粒共转染哺乳动物细胞构建假病毒［4］。多质粒共转染系统是将T7 RNA 聚合酶质粒、复制子质粒、衣壳子质粒共转染至敏感细胞，复制子在T7 RNA 聚合酶的作用下在细胞内转录。RNA 与质粒共转染系统是先将复制子质粒进行体外转录获得RNA，再与衣壳子质粒共转染至敏感细胞获得假病毒。而包膜病毒通常使用人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）、鼠白血病病毒（murine leukemia virus，MLV）等商业化载体构建假病毒［12］。

3 EV 假病毒的构建

EV 基因组为1 条长约 7 500 nt 的单股正链RNA，包括5′UTR、1 个开放阅读框（open reading frame，ORF）和 3′Poly（A）尾。ORF 编码 1 个多聚前体蛋白，可进一步水解为 P1、P2、P3 3 个前体蛋白，P1 编码VP1、VP2、VP3、VP4 4 个衣壳蛋白，P2、P3 编码 2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D 7 个非结构蛋白［14］。

假病毒主要由复制子质粒、衣壳子质粒两部分构成。其中，复制子质粒通常采用T7 启动子、EV 5′UTR、荧光素酶报告基因、2A 蛋白酶切割序列、EV非结构蛋白 P2 和 P3 序列及 3′Poly（A）尾构建；衣壳子质粒通常采用增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）、2A 蛋白酶切割序列和 EV 衣壳蛋白P1 序列构建。通过多质粒共转染系统或RNA与质粒共转染系统获得假病毒［14］。近年肠道病毒假病毒的构建情况和应用现状见表1。

表1 已构建的EV 假病毒的应用现状Tab.1 Application of constructed pseudoviruses

衣壳蛋白是决定EV 特性的核心区域，因此衣壳子质粒需使用目的病毒的衣壳蛋白区基因序列构建，而复制子质粒或复制子RNA 通常可由与目的病毒同型或同组病毒的基因组（除衣壳蛋白外）所构建。除CV-B5 假病毒外，通常使用与衣壳子同组病毒的复制子（如均为EV-A 的EV71 复制子与CV-A16衣壳子）共转染可成功获得假病毒；但使用与衣壳子不同组病毒的复制子（如EV71 复制子与CV-B3 衣壳子、CV-B5 复制子与CV-A6 衣壳子）均无法成功获得有效的假病毒，可能是由于同一种类的病毒包装机制有共同点或相似点，但不同种病毒的包装机制均不相同［29］。见表2。CHEN 等［14］采用多质粒共转染系统与RNA 及质粒共转染系统均无法获得以CVB5 基因组为复制子的CV-B5 假病毒，最终使用CVB3 复制子构建假病毒，可能是由于CV-B5 的基因结构本身不太稳定，而采用报告基因替换P1 序列的假病毒构建方式加重了该结构的不稳定性。

表2 EV 假病毒的构建Tab.2 Construction of pseudoviruses

4 假病毒在EV 相关研究中的应用

4.1 中和抗体检测 中和抗体是评价疫苗有效性、人体保护效果等方面的关键指标。因此，经验证的中和抗体方法对疫苗生产的质控和评价十分重要。传统中和抗体检测（conventional neutralization test，cNT）通常采用细胞病变（cytopathic effect，CPE）法或蚀斑减少法进行，即通过中和抗体可特异性抑制目的病毒对细胞的致病变能力，反映抗体对病毒的中和能力，但由于cNT 需要人为观察CPE 来判定结果，具有主观性强、精确度低、耗时长、操作繁琐［14］及实验室安全级别要求高等问题。为缩短检测周期，近年来，改良的酶联免疫吸附斑点试验（enzyme-linked immunosorbent spot assay）采用包被的HRP 标记单克隆抗体，可捕获病毒感染后细胞分泌的蛋白，通过酶联斑点显色的方式反映中和抗体对病毒感染细胞的能力，检测周期短（14 h）［30］、特异性高［31］，但仍需使用活病毒，且灵敏度低、线性差［27］。而基于假病毒的中和试验（pseudovirus-based neutralization test，pNT）仅需将一定拷贝数的假病毒与血清样本于37 ℃，5%CO2条件下中和数小时，随后加入病毒的敏感细胞，孵育10 ～16 h，经清洗、裂解细胞内假病毒后，加入报告基因底物，经化学发光仪检测即可准确得到假病毒含量。结果以相对光单位（relative light unit，RLU）表示，通过标准曲线的线性方程即可得到中和抗体效价，从而避免了人为观察的主观性，具有客观、准确、快速、安全性高的优势。

临床样本考核是评价检测方法的有效手段。部分 EV pNT 的临床样本考核结果［14-15，21-23］见表 3，可见 EV71、CV-A6、CV-A10、CV-B5 4 种 pNT 试验的敏感性均 ＞ 90%，敏感性较高；EV71、CV-A6、CV-A10的特异性较好，而CV-B5 的特异性较低，导致其假阳性率偏高；pNT 试验的阳性预测值均 ＞95%；EV71、CV-A6、CV-A10 的阴性预测值较高，CV-B5 较低；EV71、CV-A6、CV-A10 的约登指数较高，CV-B5相对较低。

相关性分析是反映新建检测方法的另一关键指标。作为目前公认的金标准，pNT 常以cNT 为依据，通过统计学手段进行相关性与一致性分析。已建立的 EV71、CV-A6、CV-A10、CV-A16、CV-B3 5 种 pNT均表现出了与cNT 良好的相关性（P 均＜0.000 1）和较高的一致性［4，14-15，21，23-24，26］，见表 4。PV pNT 的相关性较高（P 均＜0.01），其一致性分析采用口服脊髓灰质炎疫苗（oral poliomyelitis vaccine，OPV）、野毒株脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliovirus vaccine from salk strain，wIPV）、Sabin 株脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliovirus vaccine from sabin strain，sIPV）的免疫血清进行评价，结果表明，pNT 与cNT 的检测结果相近，均具有较高一致性。研究还使用PV-2 和PV-SabinⅡ的pNT 与cNT 检测不同疫苗免疫血清中和滴度，结果表明，当采用同一型检测毒株，两种方法具有较高的一致性［27］。提示已建立的EV pNT结果准确，可作为cNT 的替代方法用于临床样本的检测和评价［14］。

表3 EV pNT 的临床样本考核评价Tab.3 Evaluation of EV pNT in clinical samples

4.2 可视化动物模型 动物模型是疾病研究及相关疫苗、药物研发和评价的另一关键工具。由于多数EV 可对新生实验动物具有一定致病能力，但对成年实验动物不敏感，因此多数EV 动物模型只能采用新生动物模型建立，如EV71、CV-A16 等乳鼠模型。但由于新生动物免疫系统发育不完全，在疫苗保护效果等研究中只能通过免疫母体，通过母传抗体保护新生动物的能力间接进行保护效果评价。而假病毒由于可带有发光报告基因，同时又具有活病毒相应的感染能力和特性，可用于建立直观、且可动态观察的可视化动物感染模型建立，并可通过活体成像技术检测报告基因的RLU 值，定量反映病毒在动物体内特定部位的相对含量。同时，由于不需要观察动物发病或死亡情况，从而避免了只能采用乳鼠间接评价保护效果的局限性，通过活体成像技术直接检测成年小鼠的感染情况，直接反映疫苗对病毒感染的保护效果。

ZHOU 等［19］采用导入 hSCARB2 基因的 C57BL ／6小鼠建立了EV71 报告基因假病毒的可视化感染模型，通过将灭活病毒疫苗注射至动物体内，随后采用一定剂量假病毒对实验动物进行攻击，评价疫苗主动免疫的保护效果，结果显示，灭活病毒疫苗的平均保护率为88%。以BALB／c 小鼠建立的CV-B5 假病毒可视化感染模型［9］与CV-A6 假病毒可视化感染模型［22］也已成功构建，并证实了灭活病毒疫苗的免疫保护效果，为CV-A6、CV-B5 疫苗研发提供了有效的研究工具。

表 4 EV cNT 与pNT 的比较分析Tab.4 Comparison of EV cNT and pNT

4.3 抗病毒药物筛选 与中和抗体检测的方法相近，传统的抗病毒药物筛选也往往以活细胞为载体，即通过观察病毒在活细胞上引起的CPE 评价药物的抗病毒作用［32］。除具有与cNT 方法相同的缺点和问题外，还难以区分因药物本身可能对细胞存在毒性的问题。包含报告基因的假病毒可有效避免以上问题，实现快速、高通量地检测病毒感染情况，从而准确反映药物对病毒的抑制能力。但由于假病毒的报告基因在病毒粒子包装之前已经表达，对作用于病毒转录后的药物难以进行评价，使假病毒在抗病毒药物筛选中的应用存在一定局限性［32］。

SU 等［21］使用 EV71 和 CV-A16 的假病毒及感染性克隆建立了药物筛选方法，并应用该方法对400 种天然化合物库进行抗EV71 和CV-A16 药物的初筛，发现了44 种化合物可抑制报告基因的表达，经活细胞法复筛确认，证明木犀草素、高良姜素和榭皮素3 种化合物可有效抑制EV71 和CV-A16 对活细胞的感染。

5 小结及展望

目前已建立了 EV71、CV-A6，10，16、CV-B3，5、PV-1 ～ 3，SabinⅡ等 7 种 EV 的 pNT 法及 EV71、CV-A6、CV-B5 可视化动物模型，EV71 和 CV-A16 假病毒已在药物筛选中初步应用，显示了良好的应用效果和前景，但仍存在检测病原单一、方法标准化、替代野毒株cNT 法的验证等问题。应充分利用可人工构建的优势，进一步开展高通量多通道pNT 方法研究，加强pNT 与cNT 法的比较，完善方法验证和转换的依据，为EV 的疫苗评价和药物筛选提供工具。