关于新型冠状病毒mRNA 疫苗临床前药学研发和评价的思考

赵欣，杨丹，金苏

国家药品监督管理局药品审评中心，北京100022

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）于 2019 年 12 月初在我国被发现，呈现出高传染性及快速传播的特点，并可导致一定比例患者出现重症新型冠状病毒肺炎（COVID-19）。SARS-CoV-2 是一种与重症急性呼吸道综合症冠状病毒（SARS-CoV）关系密切的新型人类冠状病毒［1-2］，已在世界范围内传播并引发了全球性公共卫生危机。SARS-CoV-2 引起的临床表现包括无症状感染、轻度流感样症状、肺炎、严重急性呼吸窘迫综合征甚至死亡［3-4］。COVID-19 是一种新型人类疾病，尚无有效的治疗方法，且SARSCoV-2 的保护性免疫程序目前仍尚不清楚，存在康复患者再次感染的可能性［5-7］。因此，研制安全有效的COVID-19 疫苗是防治SARS-CoV-2 的有效手段之一。

自COVID-19 疫情发生以来，我国疫苗研发及生产企业总体上采用灭活疫苗、重组蛋白疫苗、载体疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗共5 条技术路线进行疫苗研发。mRNA 疫苗作为核酸类疫苗，凭借其自身特点，国内外多家企业正积极进行研发及申报。本文结合近年来国内外mRNA 疫苗的发展趋势及申报现状，对SARS-CoV-2 mRNA 疫苗的技术特点进行分析，结合审评实践，着重就临床前药学研发和评价的一般考虑及评价要点展开探讨，以期促进此类药物由研发顺利转入早期临床试验阶段，并加强药物研发的风险控制。

1 mRNA 疫苗的概述

Jacob 和 Monod 在 1961 年提出 mRNA 的概念，1990 年 WOLFF 等［8］证明，将体外转录（in vitro transcribed IVT）mRNA 或质粒DNA 直接注射至小鼠骨骼肌，可在注射的肌肉中表达其编码蛋白。1995 年CONRY 等［9］首次将mRNA 作为疫苗进行免疫测试。20 世纪90 年代，进行了mRNA 疫苗多种临床前应用探索，包括癌症mRNA 疫苗、传染病mRNA 疫苗等［10-14］。随着RNA 生物学、化学、稳定性和递送系统方面的技术进步，克服了直接人体注射mRNA 免疫效果差、半衰期短的一系列障碍，加速了mRNA疫苗的发展［15-16］。

核酸疫苗包括 DNA 疫苗和 mRNA 疫苗［15］，mRNA 疫苗与其他核酸疫苗理论上的主要区别包括：mRNA 一旦到达细胞质就会立即翻译，不需进入细胞核即可发挥功能；mRNA 不会整合至基因组中，不会造成插入突变的风险；多数药物应用表明，mRNA 疫苗中mRNA 瞬时表达仅有短暂活性，通过人体的自然机制代谢和消除，因此被认为是安全的；mRNA 的生产相对简单、成本较低［16-17］。

2 mRNA 疫苗的研发进展

阳离子聚合物和脂类具有将遗传物质转运进入细胞的能力，将其制成纳米颗粒转运mRNA，并进行了广泛的研究，结果表明，纳米颗粒载体具有能穿过生物屏障、提高生物相容性和延长循环时间等优点，能有效地将核酸传递至靶细胞，提高了核酸类药物疾病治疗的成功率，加速了mRNA 疫苗的发展。纳米颗粒载体对mRNA 药物的转运效率很大程度上取决于其逃逸溶酶体的能力，即纳米颗粒载体进入细胞后，经膜泡包被并传递进入溶酶体，保护包裹mRNA 免受溶酶体降解及破坏，从溶酶体成功逃离至细胞质发挥药效［18-19］。

香港大学袁国勇团队报告了COVID-19 康复患者发生再次感染的第1 例病例，研究表明，尽管由于自然感染或接种疫苗产生了群体免疫力，但SARSCoV-2 可能持续在人群中传播。对再次感染患者的进一步研究将阐明对SARS-CoV-2 免疫保护的重要因素，对疫苗的设计、研发具有重要意义［6］。

综上所述，mRNA 疫苗人体免疫的过程一定程度上模仿了病毒入侵过程，能激发人体细胞免疫和体液免疫反应。对于mRNA 疫苗的开发及质量研究，在满足常规纳米制剂药物的关键质量属性（Critical Quality Attribute，CQA）前提下，还应重点关注以下质量研究的相关方面：制剂电荷（Zeta 电位）不仅影响纳米颗粒的稳定性，还会影响纳米制剂的入胞、内体逃逸以及不良反应；mRNA 疫苗在生产过程中、终产品、稳定性研究等不同阶段纳米颗粒粒径分布的变化；制剂中阳离子聚合物及脂质成分的选择是为包裹mRNA 以达到相应药效，因此制剂的pH、脂质成分的化学结构、mRNA 包封率等，均会影响制剂成分与mRNA 复合形成纳米颗粒的稳定性、体内药物释放、药效等；mRNA 纳米颗粒在体内外表达及免疫原性相关研究，是非临床质量研究中对药物有效性、安全性研究的重要技术支持。上述药品CQA 不仅是mRNA 疫苗在人体内发挥作用机制的关键影响因素，也是药品研发及质量研究的关注点。

在COVID-19 疫情爆发以前，mRNA 疫苗已在预防性疫苗和治疗性肿瘤疫苗领域开展了多个临床研究，其中进展最快的尚在Ⅱ期临床试验阶段［20-23］。

自COVID-19 疫情发生以来，国内外多家企业正积极研发、申报SARS-CoV-2 mRNA 疫苗。国外已有两家企业对SARS-CoV-2 mRNA 疫苗的临床试验情况进行了相关报道。Moderna 公司候选疫苗mRNA-1273，采用脂质纳米颗粒包裹经核酸修饰的SARSCoV-2 Spike 糖蛋白，Ⅰ期临床试验显示，间隔28 d 2 次免疫后，抗体随接种剂量及次数增高，不良事件包括疲劳、寒战、头痛、肌痛和注射部位疼痛［24］；BioNtech 公司候选疫苗BNT162b1，采用脂质纳米颗粒包裹SARS-CoV-2 三聚化Spike 糖蛋白受体结合区域（receptor-binding domain，RBD），Ⅰ／ Ⅱ期临床中期试验显示，间隔21 d 2 次免疫后，血清中RBD 结合IgG 浓度和SARS-CoV-2 综合抗体滴度随接种剂量及次数增高，几何平均综合效价达到COVID-19 恢复期人血清的1.8 ～2.8 倍，局部及全身不良反应呈剂量依赖性，一般是轻度到中度，并且是短暂的［17］。

国内军科院联合苏州艾博公司申报的SARSCoV-2 mRNA 疫苗ARCov 已获批进入临床试验，目前尚无相关临床试验数据的报道。临床前研究表明，候选疫苗ARCoV 采用脂质纳米颗粒包裹SARSCoV-2 RBD，经肌肉免疫小鼠和非人灵长类动物，可诱导SARS-CoV-2 中和抗体及偏向Th1 的细胞免疫反应。在小鼠中接种2 剂ARCoV 可完全保护小鼠免受SARS-CoV-2 小鼠适应株病毒的攻击。ARCoV以液体配方制备，可在室温下储存至少1 周，目前正处于一期临床试验阶段［25］。

3 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗申报临床药学研究一般原则及评价思考

SARS-CoV-2 mRNA 疫苗研发总体工艺路线为选取SARS-CoV-2 蛋白，制备体外转录mRNA，研发制剂组成、开发制剂工艺、以mRNA 原液制备纳米颗粒，获得终产品。

目前全球范围内尚无mRNA 疫苗批准上市，对该类疫苗用于人体的安全性和有效性尚在探索中。同时，mRNA 疫苗创新程度较高，制剂工艺及成分相对复杂，综合考虑疫苗应用于健康人群，对其质量和安全性也提出了较高的要求。对于SARS-CoV-2 mRNA 疫苗的开发和药学技术审评，基本理念应满足疫苗产品的常规要求，此外，还应结合本品mRNA分子结构、制剂处方组成、作用机制的新特点以及不同于以往疫苗的生产工艺、质量控制等方面，进行相应的研究。下面拟结合具体药学评价实践，对相关技术审评思考进一步阐述。

3.1 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗研发风险控制相关思考

ICH Q8 提出质量源于设计（Quality by Design，QbD）的药品质量管理理念，即药物开发的目的是设计出高质量的产品，其制造过程始终如一的提供产品预期的性能。从药物研发及生产中获得的对产品的科学认知及理解有助于建立设计空间及产品质量控制体系［26］。

SARS-CoV-2 mRNA 疫苗药学评价以风险控制为核心，研发企业应结合现有科学认知及相关产业经验，在充分研究的基础上进行产品设计及工艺开发，药学研究应明确潜在的目标质量概况（Quality Target Product Profile，QTTP）、CQA、有害杂质等，SARS-CoV-2 mRNA 疫苗药学评价风险控制相关思考如下。

3.1.1 安全性风险方面 可能来源于mRNA、脂质纳米颗粒（LNP）两个方面，建议重点关注脂质相关毒性。可从非特异性免疫反应、制剂及贮存期间产生的降解产物、阳性聚合物材料本身的安全性、各类杂质累积的安全性风险等方面进行综合考虑。

3.1.2 mRNA 方面 应充分研究mRNA 修饰比例、poly A 加尾效率、加帽效率、去磷酸化程度、mRNA降解片段、mRNA 的完整性及序列的准确性、dsRNA、mRNA 含量等。其中未加帽、磷酸化mRNA、dsRNA具有非特异免疫刺激作用，是免疫学方面重点关注的杂质；mRNA 修饰具有两面性，一方面增加mRNA的稳定性，但也会增强mRNA 的非特异性免疫反应；加帽率、poly A 长度、mRNA 完整性将可能影响产物的有效性。mRNA 加帽工艺、加帽结构、加帽原材料杂质、加帽mRNA 体内外表达效率、体内外免疫原性等方面也是药学研究关注点。

3.1.3 脂质纳米颗粒CQA 除常规纳米制剂的CQA 外，还应重点关注：①电荷。zeta 电位不仅影响纳米粒的稳定性，还会影响纳米制剂的入胞、内体逃逸及不良反应；②粒径分布；③pH。制剂中含有阳离子聚合物，pH 会影响材料和mRNA 的复合；④纳米颗粒对mRNA 的包封率；⑤包封后mRNA 的完整性、功能性及含量；⑥mRNA 释放问题。

3.1.4 杂质方面 质量研究中的杂质主要包括工艺相关杂质和产品相关杂质，对影响安全性的杂质应高度重视，对其进行充分研究，包括相关杂质的产生／引入、工艺去除、可监测程度等。制剂相关杂质应重点关注：①聚正电荷材料相关杂质，包括材料合成产生的杂质及mRNA 复合过程中可能产生的杂质；②不饱和脂质的氧化及相关降解产物；③纳米颗粒聚集产生的颗粒物也是潜在杂质，应基于实际情况来评估；④未组装的脂质分子、阳离子物质、游离mRNA。未组装的脂质分子会影响LNP 的稳定性；游离mRNA 易降解，同时也可能引起非特异免疫刺激，影响产品的安全有效性。

3.2 目标抗原选择及DNA 模板设计 目的抗原的选择是mRNA 疫苗开发的基础，需对选择的抗原序列进行较为充分的研究。明确目的抗原选择的依据及其表达蛋白在预防SARS-CoV-2 中的作用机理，明确抗原序列载体构建原件结构，如帽子结构、5′非翻译区（Untranslated region，UTR）、编码抗原蛋白的开放阅读框（Open reading frame，ORF）、3′UTR、PolyA尾长度等，提供相应的选择依据及相关研究数据，需关注目的序列的优化、核苷酸的化学修饰、表达效率、免疫原性、二级结构、稳定性等方面。

3.3 mRNA 疫苗递送系统开发 mRNA 递送系统的应用保证了mRNA 疫苗的免疫原性，由于使用阳离子聚合物、脂质体等相关成分，在一定程度上增加了质量控制的难度，因此，mRNA 疫苗递送系统的开发为本产品的难点之一。

研发者应对递送系统的组成成分、配比等进行筛选研究，提供递送系统各组分的选择依据、来源，对各组分生产工艺、特性鉴定、质量控制、稳定性、杂质等进行质量研究，应按照相应法规和指导原则的要求提供申报资料。

由于国外相关企业对mRNA 疫苗研发多年，对相关技术进行了专利申报，研发企业应关注相应专利申报情况，避免专利侵权。

3.4 生产工艺及质量研究 工艺开发阶段，应进行各步工艺参数对mRNA 和 ／ 或制剂质量特性影响的研究；研发阶段应通过工艺参数的研究和优化，确立mRNA 和／ 或制剂的生产工艺及工艺过程控制策略。

临床样品制备工艺应具备一定规模，并且还应具有一定的生产连续性和放大可行性，临床样品应在符合GMP 的条件下生产。产品开发进程中应不断积累数据，持续确认工艺的一致性和可控程度。

mRNA 原液生产工艺应关注生产工艺设置的合理性，对生产工艺开发及确定提供研究资料，原液生产工艺优化应提高产品纯度及质量。mRNA 原液质量研究应关注mRNA 序列完整性、加帽率、去磷酸化、Poly A 尾长度、纯度、mRNA 序列生物活性表达、工艺相关杂质的去除、产品相关杂质残留等相关方面。

mRNA 疫苗纳米颗粒生产工艺设备的选用应考察现有制剂规模、放大能力、耗材使用次数、GMP符合情况等。纳米颗粒质量研究应关注包封率、粒径分布、纳米粒的稳定性、纯度、不完整LNP、纳米颗粒各成分含量、工艺相关杂质的去除、免疫原性等相关方面。

3.5 佐剂 鉴于mRNA 递送系统的复杂性及可能存在的佐剂作用，结合国内外在研mRNA 递送平台的实际情况，目前不建议添加单独的佐剂成分。如果需要添加佐剂，应保证添加的佐剂不会引起不可接受的毒性。临床前须通过明确的功能指标及试验研究证实佐剂发挥的具体的免疫调节作用，同时关注添加该佐剂成分后可能引入的风险，如对mRNA结构、非预期免疫反应及免疫损伤和免疫病理等。使用佐剂所带来的增强免疫应答的潜在获益必须超过其所带来的风险等。应参照佐剂相关研究指南提交全套的佐剂药学研究资料。

3.6 生物活性检测 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗为新生事物，纳米颗粒制剂组成及制备较为复杂，相应研发候选疫苗均处于研发早期，细胞水平表达活性、体内效力等综合质控指标较为重要，在研发过程中需积累相关数据。

生物学活性检测可采用体外或体内检测。研发早期阶段建议根据质量研究部分选择适宜的方法建立体内效力质控检测；必要时，根据产品的作用机理建立细胞免疫检测活性的质控检测。由于生物学活性方法存在较大的变异性，建议设立参考疫苗以适宜的比值方法予以拟定标准限度。

3.7 研发期间的工艺变更 变更是维持产品生产工艺先进性、提高产品质量和生产效率的重要手段。SARS-CoV-2 mRNA 疫苗在研发阶段，尤其是研发早期，药学变更往往不可避免。变更应以持续提升产品的安全性、有效性和质量可控性为原则，对研发产品进行持续的质量研究和趋势分析，改进生产工艺，提高生产过程控制能力，持续提升质量控制标准，提升中间产品和成品的质量控制水平［27-28］。

鼓励采用临床试验样品的工艺代表性批次开展临床前药理毒理研究。如存在临床前到临床批次的药学变更，需提供变更前后详细的药学对比信息并对变更后工艺进行详细描述、分析和风险评估，应提供相应的可比性研究数据证明变更未对产品质量产生不利影响。需提前进行可比性研究的设计，对取样批次、步骤、需要开展的检测予以提前布局，尤其需关注各个研发阶段的代表性留样问题。

如质量可比性分析研究不足以证实变更未对产品产生不利影响时，可能需要补充非临床、甚至临床研究数据，如免疫原性比较和必要的安全性比较等。鉴于mRNA 疫苗的复杂性及目前的有限认知，对于临床期间的重大变更，建议开展变更前后体液免疫、细胞免疫等全面的效力研究的比较分析。

4 结 语

SARS-CoV-2 自流行以来，我国已采取强有力的防控措施，并较好地控制了COVID-19 在我国的流行，但世界范围内COVID-19 的流行传播仍未得到有效控制。目前尚无有效治疗COVID-19 的方法，疫苗的开发及应用对于COVID-19 的防治尤为重要。

目前全球范围内尚无mRNA 疫苗批准上市，对该类疫苗用于人体的安全性和有效性尚在探索中。结合SARS-CoV-2 mRNA 疫苗国内外申报情况及相关临床试验，对于这种新型疫苗开发模式，药学研究应充分考虑其作为“创新药”的研发规律及技术特点，在保证临床用药足够安全、有效和质量可控性的前提下，应对其进行充分的风险获益评估，以评价其是否可进入人体临床试验。相信在工业界创新驱动、技术研发不断积累、对mRNA 疫苗药学研究不断深入的情况下，以及与监管风险管控的互动推进下，未来将不断有SARS-CoV-2 mRNA 疫苗获批进入临床试验以验证其对人体的安全性和有效性。