南宁市1 027例新生儿耳聋基因筛查结果分析

2020-06-08廖旺李筱瑜王宗杰黄卫彤

中国医学创新 2020年11期

廖旺　李筱瑜　王宗杰　黄卫彤

【摘要】目的：探讨GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体12SrRNA四个耳聋基因在南宁市新生儿耳聋基因检测中的应用价值。方法：随机选取2016年1月-2018年12月南宁市新生儿疾病筛查中心1 027例新生儿足跟血滤纸片，并提取DNA，应用测序法检测耳聋基因突变位点，包括GJB2（c.35del G、c.176-191del16、c.235delC、c.299-300del AT、c.109G>A、c.11 G>A）、GJB3（c.538C>T）、SLC26A4（IVS 7-2A>G、c.2168A>G）和线粒体12SrRNA（1555A>G、1494C>T）共11个突变位点。结果：1 027例新生儿中检出耳聋基因的突变者183例，占17.82%，其中GJB2基因突变176例，占17.14%，其中纯合子突变23例（c.235del C 1例，c.109G>A 22例），占2.24%;杂合子突变153例（c.235del C 10例，c.299-300del AT 1例，c.109G>A 138例，c.11 G>A 4例），占14.90%。GJB3（c.538C>T）雜合子突变1例，占0.10%。SLC26A4（IVS 7-2A>G）杂合子突变3例，占0.29%。线粒体12SrRNA（1555A>G）均质突变3例，占0.29%。本地区的GJB2和SLC26A4突变率与济宁、东莞、珠海、绍兴的突变率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：南宁市新生儿耳聋GJB2基因突变率比较高，GJB3、SLC26A4和线粒体12SrRNA基因突变率较低。致病基因以GJB2 c.109G>A为主，通过测序方法才能检测出基因突变位点比较多，有利于发现本区域的致病基因突变位点。

【关键词】新生儿基因检测突变率

Analysis of Gene Screening Results in 1 027 Cases of Neonatal Deafness in Nanning/LIAO Wang， LI Xiaoyu， WANG Zongjie， HUANG Weitong. //Medical Innovation of China， 2020， 17（11）： 0-073

[Abstract] Objective： To explore the application value of GJB2， GJB3， SLC26A4 and mitochondrial 12SrRNA in the detection of deafness genes in newborn infants in Nanning. Method： 1 027 cases of neonatal heel blood from nanning neonatal disease screening center from January 2016 to December 2018 were randomly selected. DNA was extracted and the deafness gene mutation site was detected by sequencing， including GJB2 （C.35del G， c.176-191del16， c.235delC， c.299-300del AT， c.109G>A， c.11G>A）， GJB3 （C.538C>T）， SLC26A4 （IVS7-2A>G， c.2168A>G） and mitochondrial 12SrRNA （1555A>G， 1494C>T）. Result： 183 cases （17.82%） of 1 027 newborns were found to have hearing loss， among which 176 cases （17.14%） had mutation of GJB2 gene. Among them，there were 23 cases （c.235del C 1 case， c.109G>A 22 cases） homozygous mutations， accounting for 2.24%; 153 cases （c.235 del C 10 cases， c.299-300del AT 1 case， c.109G>A 138 cases， c.11 G>A 4 cases） of heterozygous mutation accounted for 14.90%. 1 case （0.10%） of heterozygous mutation in GJB3 （c.538C>T）; SLC26A4（IVS 7-2A>G） heterozygous mutation was found in 3 cases （0.29%）. Mitochondrial 12SrRNA 1555A>G homogeneous mutation was found in 3 cases （0.29%）. The mutation rates of GJB2 and SLC26A4 in this region were statistically significant compared with those of Jining， Dongguan， Zhuhai and Shaoxing （P<0.05）. Conclusion： The mutation rate of GJB2 gene in newborns with deafness in Nanning is higher， while that of GJB3， SLC26A4 and mitochondrial 12SrRNA is lower. GJB2 c.109G>A is the main pathogenic gene， only by sequencing method can there be many mutation sites， which is helpful to find the mutation site of the pathogenic gene in this region.

[Key words] Newborn Genetic testing Mutation rate

First-authors address： Nanning Maternal and Child Health Hospital， Nanning 530011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.11.017

在我国每年有30 000例先天性听力损失的婴儿出生，在语前聋患者中，60%为遗传性耳聋，自从1997年Kelsell发现第一个人类耳聋基因，先天性聋作为遗传疾病已越来越清楚，至今已经发现了接近145个耳聋基因[1]。由于耳聋基因检测技术的广泛使用，检测时间也越来越快，耳聋基因检测将会变得越来越普遍，这对我国实现优生优育，提高人口质量提供了很大帮助。本研究主要采用测序方法对2016年1月-2018年12月南宁市新生儿疾病筛查中心1 027例新生儿足跟血滤纸片进行基因检测分析，旨在了解南宁市新生儿耳聋基因突变情况，为新生儿筛查提供遗传咨询提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象随机选取2016年1月-2018年12月南宁市新生儿疾病篩查中心1 027例新生儿的足跟血滤纸片，对其耳聋基因包括GJB2（c.35del G、c.176-191del 16、c.235del C、c.299-300del AT、c.109G>A、c.11 G>A）、GJB3（c.538C>T）、SLC26A4（IVS 7-2A>G、c.2168A>G）和线粒体12SrRNA（c.1555A>G、c.1494C>T）共11个突变位点进行检测。通过广西全民健康信息平台查看新生儿基本信息、听力初筛、听力损失确诊等资料并跟踪随访。

1.2 试剂和仪器（1）试剂盒：DNA提取试剂为北京天根生化科技有限公司，测序试剂为TAKARA Multiplex PCR Assay Kit ver.2（宝日生物技术工程有限公司）。（2）主要仪器：基因扩增仪（ABI 2720）、荧光定量PCR仪（ABI 7500）、测序仪（Miniseq）。

1.3 DNA提取方法用血片打孔器将血斑打孔得到6 mm直径的干血斑，经萃取后，用全血基因组DNA提取试剂提取DNA，用核酸浓度检测仪检测DNA浓度，其最低工作浓度应≥5 ng/μL。

1.4 GJB2基因测序方法（1）文库构建：PCR扩增。（2）文库纯化。（3）文库质检：参照KAPA Library Quantification Kit Illumina platforms TDS对文库进行定量。（4）测序：将文库pooling变性最终以1.8pM的文库上机测序。（5）数据分析方法：采用fastQC对测序数据进行质量评估，移除接头污染以及平均质量值低于20测序数据，对于总数据量低于1.2M的样品或者平均测序深度低100X的样品予以重新测序。运用bwa软件的mem模型将测序数据与人数参考基因组（hg19）进行比对后，通过Picard和GATK等软件对样品的SNV和indel进行检测，检出的基因突变采用snpEff软件进行基因注释和功能，通过SnpSift软件和dbNSFP3数据库对突变进行功能预测。（6）生物信息学分析：利用GATK工具判读SNP和Indel位点;利用Snpeff工具注释SNP，最后利用dbSNP、千人基因组数据库、HGMD等数据库、clinvar数据库进行注释和比较分析。

1.5 统计学处理采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 1 027例新生儿4个常见耳聋基因中11个突变位点情况 1 027例新生儿耳聋基因突变183例，占17.82%，其中GJB2基因突变176例，占17.14%，其中纯合子突变23例（c.235del C 1例，c.109G>A 22例），占2.24%，经过广西全民健康信息平台查看新生儿基本信息、听力初筛等资料证实该23例（c.235del C 1例，c.109G>A 22例）纯合突变均为致聋基因。杂合子突变153例（c.235del C 10例，c.299-300del AT 1例，c.109G>A 138例，c.11 G>A 4例），占14.90%。GJB3（538C>T）杂合子突变

1例，占0.10%。SLC26A4（IVS 7-2A>G）杂合子突变3例，占0.29%。线粒体12SrRNA（c.1555A>G）均质突变3例，占0.29%。c.35del G、c.176-191del 16、c.2168A>G和c.1494C>T位点未检出。见表1。

2.2 4个耳聋基因突变率与其他地区在2013-2017年的突变率比较本地区的GJB2和SLC26A4突变率与济宁、东莞、珠海、绍兴的突变率比较，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

3 讨论

本研究表1显示，南宁市新生儿耳聋基因突变以GJB2基因突变为主，突变位点c.109G>A最多，其次是c.235del C突变、c.11 G>A、c.299-300del AT，未见c.35del G、c.176del16突变。表2中显示本地区的GJB2和SLC26A4突变率与济宁、东莞、珠海、绍兴市的突变率比较，差异均有统计学意义（P<0.05），说明本地区的GJB2突变率比这四个地方的突变率明显偏高，而SLC26A4突变率比这四个地方的明显偏低。高儒真等[6]在北京市23 836例新生儿GJB2基因筛查及听力随访的意义的研究中报道主要以c.235del C突变为主，有3例c.35del G杂合子突变。李振安等[7]在佛山市40 672例新生儿耳聋基因筛查结果分析中也是以c.235del C突变为主，但未见c.35del G突变。GJB2基因的突变类型具有种族特异性，c.35del G是北欧、土耳其、美国等人群中最常见的突变[8]。赵富伦等[9]对黔西南州少数民族地区7 074例新生儿耳聋基因筛查中，该地区主要以c.235del C、IVS 7-2A>、c.299-300del AT、538C>T基因突变为主。说明不同区域人群致聋突变位点有区域性差别。王美兰等[10]和孙菲菲等[11]对耳聋基因位点109G>A的研究中都表明该基因位点会引起听力损伤。本研究经过广西全民健康信息平台查看新生儿基本信息、听力初筛等资料证实该23例（c.235del C l例，c.109G>A 22例）纯合突变均引起了新生儿耳聋。因此说明c.235del C和c.109G>A位点纯合突变在本地区属于致聋基因位点，此位点突变在耳聋基因筛查中有着重要的意义。

GJB3突变可引起常染色体显性或隐性遗传性非综合征耳聋，与高频听力下降有关[3]。阮宇等[12]在北京地区75 649例新生儿耳聋基因筛查及确诊者随访结果分析中耳聋基因突变主要以GJB2基因、SLC26A4、c.235del C和c.919-2A>G为主，孙诗雨等[13]在胶东地区非综合征型耳聋患者研究中分别以GJB2 c.235del C、SLC26A4 c.IVS7-2A>G为主，本地区以GJB2 c.109G>A为主，GJB3 c.538C>T突变仅为1/1 027（0.10%），由此可见本地区由GJB3突变c.538C>T引起新生儿耳聋发病的概率很低，这也说明了各地区耳聋基因突变位点各有不同，但由GJB3基因突引起的耳聋都非常低。GJB3基因538C>T突变的新生儿虽然听力筛查正常，但可能出现后天听力下降，仍需高度重视并定期跟踪随访[14]。

SLC26A4基因又称PDS基因，位于人类染色体7q31，编码含有780个氨基酸的蛋白质Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸组成，是一种跨膜蛋白。SLC26A4基因某一位点的突变导致Pendrin功能障碍，引起Cl-转运障碍或耳内淋巴液流动异常，引起前庭水管扩大（enlarged vestibular aqueduct，EVA）和内淋巴管内压升高，内耳毛细胞受损和听神经萎缩，从而导致听力下降[1]。本研究1 027例新生儿中SLC26A4突变以IVS 7-2A>G杂合突变为主，占0.29%（3/1 027），未见c.2168A>G 位点突变。SLC26A4基因突变携带率比济宁、东莞、珠海、绍兴市这四个地区的携带率明显偏低。钱根才等[15]在浙江省长兴县2 108例新生儿耳聋基因筛查结果分析中报道该地区基因突变中以GJB2突变为主，其次为SLC26A4基因突变。刘璟等[1]在大连地区语前聋患者与耳聋高危人群中的检测分析研究中，语前聋患者IVS 7-2A>G突变携带率为18.57%（143/770），SLC26A4基因被认为仅次于GJB2突变引起遗传性感音神经性聋的遗传学病因[16]，说明南宁市新生儿耳聋基因中以IVS 7-2A>G突变发生率比其他地区少。

氨基糖苷类抗生素毒性耳聋与线粒体12SrRNA基因突变密切相关，部分患者对氨基糖苷类抗生素有易感性，对线粒体12SrRNA基因突变新生儿禁止使用耳毒性药物[17]。因此，新生儿筛查线粒体12SrRNA基因突变，可预防药物性耳聋的发生。携带线粒体12SrRNA 1555A>G突变的个体在世界范围内均有发现，但存在一定的地域偏向，以亚洲人群为主，其中中国人群占世界总人数的72.6%，（1 736/2 390）（在亞洲人群中则占85.3%），亚洲以外的其他国家对线粒体12SrRNA 1555A>G突变报道的较少，占14.9%（355/2 390）[18]。本研究显示南宁市新生儿线粒体12SrRNA 1555A>G突变携带率仅为0.29%，未见c.1494C>T位点突变。线粒体12SrRNA基因突变携带率与济宁、东莞、珠海、绍兴市比较无明显差别。据报道12SrRNA基因突变的患者约有50%为先天性耳聋，其余50%为耳毒性抗生素诱发，发病期的平均年龄为5岁[19]。所以携带12SrRNA基因的患者很容易因药物的影响，而引起听力损伤，甚至耳聋，因此值得高度重视。

综上所述，本地区新生儿耳聋基因携带以GJB2基因突变为主，其中109G>A位点纯合突变是引起本地区新生儿听力受损的主要耳聋基因之一。由于基因芯片法检测不出GJB2基因中109G>A、11G>A两个位点，而测序法除了能够检测出和基因芯片法一致的基因位点外，还能检测出此两个位点，说明测序法比基因芯片法在耳聋基因检测方面更全面，能为临床提供更多的诊断依据，所以测序法比基因芯片法更适合用于临床筛查耳聋基因。新生儿耳聋基因和听力联合筛查可以有效地提高听力障碍及高危儿的检出率[20]。所以有了好的检测方法还需要与听力筛查相结合，这样才能更好地帮助临床医生做出临床诊断和干预措施。

参考文献

[1]刘璟，牟书瑜，付敏，等.常见耳聋基因在大连地区语前聋患者与耳聋高危人群中的检测分析[J].听力学及语言疾病杂志，2016，24（6）：545-548.

[2]孙磊.济宁市耳聋基因普遍筛查模式探索[J].中华耳科学杂志，2016，14（5）649-653.

[3]巫静帆，李小霞，谭淑娟，等.东莞户籍33810例新生儿听力筛查联合耳聋基因检测与分析[J].中华耳科学杂志，2018，16（2）：176-180.

[4]潘力，苏文，林道彬，等.珠海地区9775例新生儿常见耳聋基因突变筛查结果分析[J].广东医学，2017，38（17）：2684-2687.

[5]杨晶群，余红，刘丹.绍兴地区7172例新生儿耳聋基因突变位点分析[J].中国优生与遗传杂志，2017，25（5）：96-97.

[6]高儒真，陈晓巍，历东东，等.新生儿GJB2基因筛查及听力随访的意义[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2015，29（4）：314-318.

[7]李振安，余凤慈，包永新，等.佛山市40 672例新生儿耳聋基因筛查结果分析[J].妇产与遗传杂志，2017，7（1）：47-50.

[8]刘丽益，李维，韩璐好，等.深圳市南山区25987例新生儿耳聋基因筛查结果分析[J].中国优生与遗传杂志，2018，26（3）：75-77.

[9]赵富伦，梁光丽.黔西南州少数民族地区新生儿耳聋基因流行病学调查[J].世界最新医学信息文摘，2018，18（81）：178.

[10]王美兰，马静，明澄，等.云南地区新生儿遗传性耳聋基因联合听力筛查结果分析[J].中国医学文摘耳鼻咽喉科学，2018，33（6）：439-443.

[11]孙菲菲，胡松群，唐艳，等.高通量基因捕获测序技术在12个耳聋家庭中的应用[J].山东大学耳鼻喉眼学报，2017，31（5）：45-49.