金黄色葡萄球菌生物膜形成及其与持留菌关系研究进展

景双艳 综述，魏莲花 审校

1.甘肃省人民医院，甘肃兰州730000；2.甘肃中医药大学，甘肃兰州730000

金黄色葡萄球菌是人类最重要的病原体之一，属革兰阳性球菌，可引起皮肤和软组织感染、骨髓炎、心内膜炎、手术部位感染、肺炎及败血症等多种疾病，是引起医院感染常见菌。全球抗生素耐药性的出现对医学产生了严重的威胁，近年来，随着耐药菌株的不断增加，葡萄球菌感染的治疗变得越来越困难。在美国，耐抗生素的患者至少200 万人，每年造成2.3 万名患者死亡。金黄色葡萄球菌耐药菌株引起的感染已在全球范围内传播和流行［1］，而耐药病原体（如粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌）形成的对抗生素高度耐受的生物膜进一步加重了病情，最终导致疾病的持续性及复发性感染［2］。1940年，先后发现抗金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），因此，迫切需要采用新作用机制的治疗方法。而生物膜及持留菌的形成是导致金黄色葡萄球菌难治疗的主要因素，目前，在防治金黄色葡萄球菌生物膜感染方面还处在体外及表观研究阶段，细菌感染治疗的困难很大程度上是由于一小部分持留菌的存在。持留菌是一种耐药细胞亚群，通常与慢性和复发性感染有关，持留菌最终恢复率＜1%［3］，这些细菌或是完全休眠的，或是选择性灭活的，通常为抗生素的靶点，其表型变异具有短暂的抗生素耐受性，能够承受广泛的抗生素治疗，当抗生素压力下降时，可恢复生长。金黄色葡萄球菌中的持留菌可通过多种抗生素刺激产生［4］。

本文对金黄色葡萄球菌生物膜的形成及调控、持留菌对生物膜的影响及两者的相互关系作一简要综述，并对未来治疗潜在抗持留菌的方法进行展望。

1 金黄色葡萄球菌生物膜形成及群体感应系统调控因素

生物膜为高度结构化的表面相关的微生物群落，被封闭在一个自我生产的保护细胞外基质中［5］，其与抗微生物化合物耐药性的增加有关，且较少受宿主免疫因子的影响。已知细菌生物膜能导致75%以上的人类被微生物感染［6］，因此，迫切需要抗菌药物，不仅针对耐多药的病原体，减少抗生素的使用及降低其副作用，而且要消除生物膜。帮助解决耐药性问题的一项重要潜在战略是发现和开发能部分或完全抑制细菌耐药性机制的新型活性药物。

葡萄球菌感染很难根除的原因是生物膜中的细胞对抗菌药物具有高度耐药性［7］。生物膜为一种多细胞的三维细菌集合体，嵌入由多糖、细胞外DNA、蛋白质和（或）酯质组成的基质中［8］，是适应环境压力而形成的。金黄色葡萄球菌的生物膜由于能附着在活体组织及植入的医疗设备上（人工心脏瓣膜、导管、关节假体等），以及对抗生素固有的顽固性［9-10］，其相关的感染导致发病率、死亡率及医疗费用的增加。生物膜相关的葡萄球菌感染广泛存在，生物膜除提供一个环境生态位之外，还在慢性疾病的进展中发挥重要作用，近年来用于治疗细菌感染的抗菌药物并不能根除生物膜。此外，细菌病原体适应及耐受抗生素为临床治疗增加了难度。

群体感应为一种细胞与细胞之间的交流机制，细菌利用该机制调节基因表达以应对细胞密度的变化。金黄色葡萄球菌群体感应（quorum sensin，QS）系统在附属基因的控制下监管agr，agr 被认为是毒力的主要调节因子，其通过调节大量毒力相关分泌产物（包括细胞溶酶、蛋白酶、酚溶调节素、脂肪酶和超抗原［11］）表面蛋白来控制生物膜的形成［12］。

2 持留菌对生物膜的影响

2． 1 持留菌的形成 持留菌为细菌种群中所占比例不到 0． 1%的一类特殊亚群，具有与种群内普通菌及抗性突变菌所不同的特征，其形成机制复杂，不易分离培养。持留菌可通过“休眠-生长-增殖”应对逆境的胁迫，维持自身生存及菌体结构稳定，在生物膜的多药耐受性及多金属耐性中发挥着重要作用，对维持微生物群落结构稳定具有重要意义。有研究证实，耐药细胞在新鲜的不含抗生素的培养基中培养后，可恢复对抗生素敏感的状态，表明这些细胞不是突变体，而是具有可逆耐药的持留菌［13］。

持留菌的形成通常与抗生素耐药机制有关，归因于接种条件、培养生长阶段、抗生素的使用以及操作过程中的严格控制，这是一种既不生长也不死亡的细胞亚群［14］，在环境及生理变化的反应中，有时是自发的，细菌细胞产生不同类型的特定亚群，以更好地生存。持留菌具有暂时的耐抗生素表型，与公众认知的耐药菌不同，其药物作用的靶点未变异，仅是被抑制，处于休眠状态。1944 年，BIGGER［15］在实验中无法用青霉素完全消除培养的葡萄球菌，在去除抗生素治疗后，存活下来的持留菌重新接种到一个新的遗传多样性群体中，该群体与原始群体不同，耐药性细胞的比例与在原始培养中观察到的相同，结果表明，持留菌由于短暂的转换而具有多药耐受性。持留菌的形成最初被认为是一个随机过程，是由基因相同群体中单个细胞内的基因及蛋白表达水平的波动引起的［16］，因此，持留菌被认为是独立于抗生素及其他环境信号的存在而形成的。持留菌通常是从静止期培养物中分离出来的，这是一个主要的营养限制条件，被认为是持留菌形成的主要触发信号之一。随后，LEWIS［17］及 FISHER 等［18］陆续发现，在所有主要病原体中均有持留菌。BIGGER［15］认为，在非治疗期间，部分或间歇的灭菌可使存活下来的持留菌复苏。综上证据表明，持留菌为慢性感染顽固性的罪魁祸首，其阻碍了有效的治疗。

2． 2 持留菌与生物膜之间的联系 持留菌在微生物中定义为随机形成或对压力（包括对细菌的抗生素）作出反应的常规细胞的休眠体。持留菌的形成可诱导细菌种群内的非遗传异质性（尤其是“生物膜”），进而可能有助于对环境变化的功能适应［18］。有研究发现，在菌落生物膜培养过程中，这种持留菌的增强及其记忆效应在其他细菌物种中或多或少是常见的，不仅适用于革兰阴性菌（不动杆菌及沙门菌），也适用于革兰阳性菌（葡萄球菌和及芽孢杆菌）［4，17］。生物膜中的细菌细胞比浮游生物表现出更高的抗生素耐药性［19］，该抗性与持留菌形成之间的关系已被证实。LEWIS［17］提出持留菌在生物膜耐受中可能发挥作用。LEVIN 等［20］提供了数学证据证明持留菌的存在确实会阻碍细菌感染的有效治疗。多数与慢性或难以治疗的感染相关的病原体中均存在持留菌，包括大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及真核白色念珠菌。持留菌通过生物膜基质从物理上保护人类免疫系统，从而确保在抗生素治疗停止时的生存。生物膜在细菌中可作为一种屏障保护持留菌在高浓度的抗生素环境中幸存，当高浓度抗生素存在时，生物膜中游离的细胞均被杀死，而持留菌进入休眠状态，游离的持留菌被人体的自身免疫系统所清除，而存在于生物膜中的持留菌在生物膜的保护下逃逸免疫系统的攻击，当抗生素的压力降低或环境再度适宜该持留菌时，即结束休眠并恢复生长［21］。在每一种病原体中均能发现持留菌，这有助于观察抗生素在生物膜中的耐受性及其导致疾病的慢性感染性原因。因此，对持留菌细胞的有效治疗可极大改善患者的预后。

在生物膜中，细菌可定位于营养有限的小环境，然后可能进入一种暂时的生理状态，使他们能够耐受抗生素［17］。菌落生物膜培养对持留菌形成的促进作用及由此产生的记忆效应，在多种细菌中常见。有研究表明，菌落-生物膜培养后所形成的的持留菌细胞状态至少可维持4 周［22］，已经证明抗生素确实能穿透生物膜并在不杀死细菌的情况下到达细胞内［23］。

2． 3 持留菌的根除 慢性持续性细菌感染是重要的临床问题，多种细菌可引起持续性感染，包括结核分枝杆菌、沙门氏菌、衣原体、布鲁氏菌、博氏菌、假单胞菌、致病性大肠埃希菌、葡萄球菌、链球菌［24］。如何找到有效的治疗方案来根除顽固性细菌感染是一个重大的挑战。一种方法是延长使用现有抗生素治疗慢性感染的时间［25-26］，目前已提出对结核分枝杆菌及铜绿假单胞菌的固定培养物进行消毒［27］。裂解性噬菌体已被证明可感染大肠埃希菌，当细菌恢复生长时，这些噬菌体可裂解细菌，表明噬菌体疗法可能是一种很有希望根除持留菌的策略［28］。另一种有效方法通过小分子化合物（化学文库的筛选已确定了一些化合物）影响个体，迫使其恢复到抗生素敏感的状态而起特定作用［29］，或通过影响种群的所有细菌细胞而起特定作用［30］。LEWIS［17］小组证明，一种小型化合物（酰基脱硫肽，ADEP4）可在传统实验箱培养生物膜及小鼠感染模型，从而有效杀死金黄色葡萄球菌。

3 小 结

本文总结了金黄色葡萄球菌的生物膜及持留菌的关系，对持留菌临床重要性的普遍认识有促进作用，对持留菌的研究主要集中在其特定抗生素耐受方面，因此，抗生素暴露是解释持留菌存在的一种方式。随着对控制不同病原体持留菌机制了解的不断深入，生物膜及持留菌的调控因素均可能是药物潜在的靶点，从而为临床更好治疗复发性和难治性细菌感染提供理论依据，为临床抗细菌治疗提供方向。