《世界卫生组织肠道病毒71 型灭活疫苗质量、安全性及有效性指导原则》的制订背景及要点简介

毛群颖，高帆，贺鹏飞，梁争论，徐苗

中国食品药品检定研究院，北京102629

2020 年10 月23 日，《世界卫生组织肠道病毒71 型灭活疫苗的质量、安全性及有效性指导原则》（以下简称指导原则）经生物制品标准化专家委员会（Expert Committeeon Biological Standardization，ECBS）审议通过。该指导原则的通过对全球重症手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）疫情的防控及我国肠道病毒 71 型（enterovirus 71，EV71）疫苗申请世界卫生组织（World Health Organization，WHO）预认证，进入联合国疫苗采购清单，促进我国EV71疫苗走进国际市场至关重要。同时也是我国成为WHO 生物制品标准化和评价合作中心以来，对WHO 疫苗标准制订方面的重要贡献。简要介绍该指导性文件的制订背景和主要内容对我国更多参与国际标准制订、更好理解和应用该指导原则，提升我国疫苗研发、生产和质控理念，促进疫苗国际化具有重要意义。因此，本文针对该指导原则的起草背景、中国的技术支撑及重点内容作一介绍。

EV71 灭活疫苗的质量、安全性及有效性指导原则是WHO 为确保EV71 疫苗的质量及安全、有效而制订的，旨在为全球监管机构及疫苗生产企业提供的关于EV71 灭活疫苗生产过程、质量控制、非临床评价和临床评价的指导性文件。为促进全球重症HFMD 的防控和EV71 疫苗的研发、生产和应用，2020年WHO 在第72 届ECBS 会上审议通过了第一部WHO EV71 灭活疫苗质量、安全性及有效性指导原则。该指导原则的制订是由WHO 组织来自全球学术界、国家监管当局、国家控制实验室及疫苗研发与生产企业的相关专家，根据中国已获批上市的3 种EV71 疫苗、候选 EV71 疫苗［1-9］及其他灭活病毒疫苗［如灭活脊髓灰质炎疫苗（inactivated poliomyelitis vaccine，IPV）］与甲型肝炎疫苗［10-11］的经验提出。

由于目前重组类及其他类型的EV71 疫苗或EV71-CA16 二价疫苗等均处于研发早期阶段，该指导原则仅适用于以哺乳动物细胞培养、采用甲醛或其他化学灭活剂制备的EV71 全病毒灭活疫苗。同时应结合现行WHO 关于疫苗非临床评价［12］、临床评价［13］、生物制品生产质量管理规范（GMP）［14］、细胞库［15］、疫苗佐剂和含佐剂疫苗的非临床评价［16］及批签发［17］等指导原则。

1 起草背景

EV71 除可引起轻症HFMD 外，还可导致患儿出现脑干脑炎、无菌性脑膜炎、急性脊髓炎、急性小脑共济失调、神经源性肺水肿和心肺衰竭等重症疾病，是导致我国乃至全球重症HFMD 的主要病原体。重症患儿具有起病急、病程进展迅速、病死率高、可导致认知障碍等神经系统后遗症的特点［18］。自1969 年首个EV71 在美国成功分离以来［19］，全球均有流行或暴发报道［20-25］。1998 年，中国台湾地区暴发EV71 流行，共有405 例重症病例入院治疗，死亡 78 例［26］。中国大陆自 2008 — 2015 年，共报道1 381 万例报告病例，死亡3 342 例，占中国大陆丙类传染病总死亡人数的90.3%［27］。另外，马来西亚、新加坡、缅甸、日本、和越南等国家均有重症病例和死亡病例的报道［21-25］。EV71 感染在亚太地区呈发病率高、流行范围广、重症和病死人数增多的流行特征。除亚太地区外，EV71 引发的HFMD 在非洲、欧洲和美洲等地区也有散发或小规模暴发流行。美国、英国、加拿大、新西兰、挪威等国家均有HFMD 流行的报道，其中美国和英国出现了重症和死亡病例［28］。EV71 已成为后脊髓灰质炎时代最严重的噬神经系统肠道病毒。

EV71 灭活疫苗是我国自主研制的、全球唯一可预防EV71 重症HFMD 的新型疫苗［29］。该疫苗是采用病毒培养、纯化、灭活和佐剂吸附工艺生产的全病毒灭活疫苗，经3 万余名婴幼儿临床试验证实，疫苗保护效果均达90%以上，且安全性良好［1-3］。2015年12 月，分别由中国医学科学院医学生物学研究所、北京科兴生物制品有限公司和武汉生物制品研究所有限责任公司生产的3 个灭活疫苗产品先后在我国获批上市。目前已对我国31 省、直辖市和自治区的4 000 余万名婴幼儿接种使用，我国HFMD 死亡人数显著下降，至2018 及2019 年已较疫苗上市前的平均死亡人数下降了92.7%和95.8%［27］，有效控制了我国的EV71 疫情。

在该背景下，中国食品药品检定研究院（以下简称中检院）专家和WHO 专家充分沟通，建议WHO 制订 EV71 疫苗指导原则，对促进全球EV71 疫苗研发、生产、应用及评价，确保全球受EV71 威胁的婴幼儿可获得安全、有效的疫苗进行防护具有重要意义。

2 中国EV71 疫苗质量研究对WHO 指导原则制订的技术支撑作用

2.1 中国EV71 疫苗质控平台的建立 EV71 疫苗是在中国国家重大专项重点支撑下，集产、学、研、检为一体集成研发创建的具有我国自主知识产权的新型疫苗。为确保疫苗研发、生产和质控水平，中检院在疫苗研发早期即开展了EV71 疫苗流行病学、免疫原性、动物模型建立及交叉保护等研究，揭示了EV71 血清流行病学特性、EV71 疫苗免疫原性和交叉保护效果，为该疫苗研发和评价奠定了基础［30-36］。同时，为创建EV71 疫苗质控体系，有效确保EV71疫苗安全、有效和质量可控，与国内同行开展EV71中和抗体检测方法学［37］，建立了EV71 疫苗国家中和抗体标准品［38］、EV71 疫苗标准检测毒株［39］、EV71疫苗国家抗原标准品［38］、EV71 疫苗国家效力参考品［40］及中和抗体标准化检测程序，建立了标准化中和抗体检测平台及临床免疫原性评价平台，有力支持我国3 家疫苗产品的临床保护效果评价，推动我国EV71 疫苗的获批上市［29］。

2.2 国际EV71 标准品的建立 为促进全球EV71疫情防控及我国独创疫苗走入国际市场。2012 年，应中检院邀请，WHO 标准物质研制资深单位英国国家生物制品检定所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）专程来华就我国的EV71 疫苗研发和质量控制研究首次进行了深入沟通交流，并得到NIBSC 高度认可，于当年即向WHO递交了合作开展EV71 国际标准品研制的申请并获批。2013 年，中检院与NIBSC 正式签署了EV71 国际标准研制合作意向书，开启了EV71 疫苗国际标准的研究历程。随后，在双方科学家的共同努力下，针对国际标准物质及其他关键问题，收集全球9 个基因亚型的EV71，建立了多基因型EV71 病毒库；采用具有高中和活性和广谱交叉能力的单抗，建立EV71国际通用抗原检测试剂，先后解决了EV71 中和抗体交叉保护、EV71 抗原特性评价及候选标准物质筛选等关键问题，完成了候选标准品的制备，最终经国际协作标定证实候选标准品可显著降低实验室检测误差，有效保证EV71 疫苗质控、评价的准确性、重复性和可比性。2015 和2019 年成功研制了第1 代EV71 中和抗体国际标准品（14 ／ 140）、第 1 代 EV71中和抗体国际参考品（13 ／ 238）［41-43］、第 1 代 EV71疫苗国际标准品（18 ／ 116）、第 1 代 C4 型和 B4 型EV71 疫苗国际参考品（18 ／ 120 和 18 ／ 156）［44-45］，上述相关研究不但填补了EV71 国际标准研制的空白，且开创了我国主导研制国际生物制品标准品的先河。同时，系列国际标准品和参考品的建立，也为WHO 指导原则的制订奠定了基础。

2.3 中国质量控制和评价技术要点的发布 为促进WHO 指导原则的制订，2016 年中检院组织制订和发布了我国首部《EV71 疫苗质量控制和评价技术要点》［46］。在该技术要点中重点关注EV71 疫苗生产的质控和评价，强调生产全过程的一致性，明确标准物质和趋势分析，提出了风险前置等质控理念。该技术要点的颁布不但进一步规范了我国EV71 疫苗的生产和质控，确保我国上市疫苗的质量安全稳定、可靠，同时也为WHO 指导原则的制订提供了初稿，有力推动了WHO 指导原则的制订。

3 WHO EV71 疫苗指导原则的制订

2016 年我国首次在WHO ECBS 会议上提出了制订EV71 灭活疫苗的质量、安全性及有效性指导原则的建议。并于2017 和2018 年，先后组织召开了中日韩第三届疫苗研究及质量控制研讨会和第四届WHO 疫苗标准化和监管评价合作中心国际会议，利用这两个国际会议平台，将《EV71 疫苗质量控制和评价技术要点》提请国际专家讨论，并初步探讨EV71 灭活疫苗WHO 指导原则的框架和主体内容。通过与WHO 及国际专家的多次沟通讨论，最终推动WHO 于2019 年在我国上海召开了“肠道病毒71 型（EV71）灭活疫苗的质量、安全性及有效性指导原则制订工作会议”，会议确立了指导原则的编写原则和方案，成立由我国包括王军志院士等7 名国际权威专家构成的指南起草专家组，正式启动该指导原则的编写和制订工作。在起草专家组及国内外业内专家的共同努力下，2020 年4 月该指导原则的编写工作顺利完成。经1 个月公开征求意见，2020 年7 月在综合全球专家意见和建议的基础上，形成了最终版并递交 ECBS 审评（WHO ／ BS2020.2388）［47］。2020 年 10 月 19 — 23 日，由包括 ECBS 专家委员、顾问、国际组织代表及WHO 专家和各国监管部门代表等100 余位专家，对该指导原则再次进行了逐条讨论后，第一部《世界卫生组织肠道病毒71 型灭活疫苗的质量、安全性及有效性指导原则》顺利通过第72 届WHO ECBS 会议审议，为确保全球EV71 疫苗的质量、安全和有效性提供了指导原则。

4 WHO EV71 疫苗指导原则的要点简介

该指导原则主要包括EV71 疫苗的生产制造、非临床评价、临床评价及对国家监管机构（National Regulatory Authorities，NRAs）的指导建议 4 个部分。以下对指导原则的主要内容和制订过程中专家关注和讨论的焦点问题作一介绍。

4.1 生产制造 本部分主要介绍了从细胞库和种子批到EV71 疫苗培养、纯化、灭活及配置的全过程和质量控制，其中着重关注安全性和有效性。

4.1.1 病毒灭活 为确保疫苗安全性，生产企业应建立良好的纯化、灭活程序，以确保病毒完全灭活且无残留传染性，并进行充分验证，保证疫苗安全性。根据IPV 生产工艺经验建议采用纯化、过滤和灭活顺序，并对病毒灭活前、灭活中和灭活验证均提出了详细要求。

4.1.1.1 病毒灭活前 应进行病毒滴度、抗原含量、比活等检测；应采用0.22 μm 滤膜进行过滤，以去除颗粒物和其他干扰物质，并在过滤后24 h 内开始病毒灭活，中间间隔时间最长不超过72 h。应保留病毒过滤后灭活前的样本，进行病毒滴度检测，以监测病毒灭活动力曲线。

4.1.1.2 病毒灭活 灭活方法应证明可持续灭活EV71，且不破坏病毒抗原活性和免疫原性。灭活过程应监测病毒滴度，灭活周期通常应大于使病毒滴度降至检测不到时间的2 倍。灭活过程中应进行第2 次过滤。灭活动力曲线应至少4 个时间点，以显示活病毒浓度随时间的降低情况。应测定灭活前、灭活中和灭活结束时每一个灭活容器的病毒滴度和抗原含量。应至少对5 个连续批次病毒进行灭活效果和动力学的一致性监测。

4.1.1.3 灭活验证 取样量应不少于总体积的5%或1 000 剂成品，并接种敏感细胞。接种病毒的稀释度应不大于1 ／ 4，每毫升样品应接种不少于3 cm2细胞。如采用甲醛作为灭活剂，则样品应采用亚硫酸氢盐中和，透析后检测。样品培养时间应不少于21 d，期间至少进行2 次细胞传代。在灭活验证同时或结束时，应接种阳性对照（少量的活病毒），以保证检测方法的灵敏度。在接种后5 ～7 d 内应及早更换培养液，以保证培养液处于良好状态。

4.1.2 质量控制 为确保有效性，提出效力试验应进行体内、体外效力（抗原含量）两方面检测。在抗原含量检测中应采用经验证的免疫化学方法，并采用经第1 代EV71 疫苗国际标准品标定的标准品检测。一旦获得连续足够批次的数据证实生产一致性，且证实体内外效力标准具有可比性，则体内效力可省略。如疫苗含有佐剂，应解吸附后再进行检测。如疫苗中含有其他抗原，则应证明EV71 抗原检测方法的适用性。如EV71 抗原检测方法不适用，则应采用体内效力法进行。

4.2 非临床评价 包括产品特性工艺开发、免疫原性、动物保护及安全性4 个部分。其中着重强调交叉保护，建议在动物模型中进行交叉攻毒保护研究，以评估对不同基因型或异源病毒的保护力，证明疫苗保护的广度。

4.3 临床评价 由于目前研究已获得充分数据证明EV71 灭活疫苗的保护效果，因此在临床评价中同样对交叉保护提出了重点关注，包括疫苗免疫个体对不同基因型、不同毒株的交叉能力及对流行病毒的进化、变异进行监测，如果疫苗上市国家出现新的亚种群病毒，需要对潜在的交叉保护能力进行深入的临床调查。

4.3.1 实验室检测 包括血清学检测和病原检测，基于目前已建立良好的EV71 中和抗体检测方法，在血清学检测中鼓励开发高通量检测方法，同时检测应采用第1 代EV71 中和抗体国际标准品和国际参考品。在病原检测中提出由于多种病原可导致HFMD，应采用特异性良好的方法确认病原。

4.3.2 免疫原性 免疫剂量和免疫程序的确立应重点关注免疫前抗体阴性人群，探索获得良好免疫应答的最小剂量和最短间隔周期。应该关注交叉保护，建议使用系列临床分离株进行研究，并关注自然感染者。

4.3.3 有效性评价 应在临床上证明对EV71 所致HFMD 和疱疹性咽峡炎具有明确的保护作用方可获批上市。疾病的定义建议为一种发热伴有口腔黏膜、手、脚或臀部的丘疹或水泡疹的疾病。严重病例的定义应参照WHO 所述的神经、呼吸或循环系统相关并发症。EV71 感染的实验室确认建议当满足以下一点可确认为EV71 感染：①膀胱 ／ 咽拭子或粪便中EV71 RNA 的检测阳性；②病毒分离与VP1序列分析证明为EV71；③EV71 IgM 阳性。

4.4 对各国NRAs 的建议 与其他疫苗相近，提出对于一个新产品批准上市，制造商应充分证明新产品的质量一致性；并对生产、质控及可能影响EV71 灭活疫苗质量、安全性或有效性的任何重大变更，均应与NRAs 讨论并获得NRAs 的批准；为保证质量一致性，应采用国际标准品标定国家或工作参考物质等要求。

5 小 结

WHO EV71 疫苗指导原则是为确保EV71 疫苗的质量安全有效，为全球监管机构及疫苗生产企业提供关于EV71 灭活疫苗生产过程、质量控制、非临床评价和临床评价的指导性文件。该指导原则是在我国的大力推动下，在完成两个国际标准品研制的基础上，主导建立的首个EV71 疫苗国际文字标准。在指导原则制定过程中，国际专家充分尊重国内疫苗研发和审评审批的成功经验，同时，融入国际上IPV 和甲肝疫苗等同类疫苗国际标准的先进经验和国际要求，我国监管和研发专家通过深度参与国际标准的制定，对疫苗国际指南的制定原则有了更深入的了解和把握，对今后疫苗研发也有很多借鉴意义。该指导原则的制订不仅为全球EV71 疫苗的研发、生产、评价及应用提供了基本原则，为促进全球EV71疫情防控提供了关键指南，同时还可有力推动我国独创疫苗走入国际市场，显著提升了我国生物制品的国际影响力，开创了我国疫苗国家标准向国际标准的升级。

志谢感谢中国食品药品检定研究院的王军志院士和王佑春首席对本研究的特别贡献