槲皮素调控GSTP1甲基化抑制前列腺癌LNCap细胞增殖的机制研究

邢红宇，朱明月，李 伟，林 波

前列腺癌是多发生在40岁以上成人的一种恶性肿瘤，男性恶性肿瘤前列腺癌发病率明显升高，在新发现的确诊病例中大多为局部晚期或广泛转移患者，主要以手术治疗为主，化疗、放疗等其它疗法为辅，无法根治性治疗，预后较差[1-2]。谷胱甘肽S-转移酶P1(glutathione S-transferases pi-1,GSTP1)具有保护细胞DNA碱基不受伤，抗肿瘤等功能。GSTP1表达沉默是正常前列腺上皮转化为前列腺腺癌的标志[3]。槲皮素广泛分布于植物中，具有多种生物作用，如抗氧化、清除自由基、抗感染、抗菌、抗病毒、免疫调节等作用[4]。GSTP1基因启动子区Cp G岛甲基化是药物治疗前列腺癌的重要有效靶点。针对GSTP1的靶向治疗，探讨槲皮素对前列腺癌细胞(prostate cancer cells,LNCap)细胞GSTP1启动子甲基化的影响与LNCap细胞增殖机制的关系，为肿瘤靶向治疗提供临床医疗机制支持。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器酶标仪(型号: DG3022A)购自南京华东电子集团医疗装备有限责任公司；细胞培养箱(型号: J-80B-III)购自上海杰涵实验设备有限公司；蛋白印迹仪(型号: PROFIBLOT 48) 购自北京博宇腾辉科贸有限公司；流式细胞仪(货号: BeamCyte，1026)购自常州必达科生物科技有限公司；CCK-8试剂盒(货号:D190411)购自上海钰博生物科技有限公司；RNA提取试剂盒(批号:D1937)、反转录试剂盒(批号:D1932)、PCR检测试剂盒(批号:D1946) 购自哈尔滨经纬百科生物技术有限公司；RPMI-1640 培养基(批号:507739)购自美国GIBCO公司；胎牛血清(批号:11019-8634) 购自杭州亿枫生物公司; EZ DNA Methylation-Gold KitTM甲基化试剂盒(货号: D5005)购自北京天漠科技开发有限公司；膜联蛋白V(异硫氰酸荧光素碘化丙啶(fluorescein isothiocyanate propidium iodide,FITC /PI) 细胞凋亡检测试剂盒(货号: T2190)购自上海恒斐生物科技有限公司；槲皮素(Solarbio，批号: IQ0010 -1) 购自上海恒斐生物科技有限公司；LNCaP细胞(编号: C0787) 购自上海冠导生物工程有限公司。鼠抗GSTP1购自南京碧云天生物科技有限公司；兔抗β-肌动蛋白(β-actin)和辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠二抗均购自美国 Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1分组及处理 体外培养LNCap细胞，分为空白组、低浓度组、中浓度组、高浓度组及对照组。空白、低、中、高浓度组分别使用(0、10、40、80 μmol/L)槲皮素处理，对照组使用甲基转移酶抑制剂5′-氮杂-2′-脱氧胞苷(5′- Aza-2′- deoxycytidine,5′-Aza-dC)(10 μmol/L)处理48 h。

1.2.2CCK-8检测各组LNCap细胞增殖 从加入药物处理开始，每隔12 h收集按实验分组培养后的LNCap细胞消化离心，弃上清液，加MTT，孵育4 h，加入DMSO，按分组使用酶标仪检测LNCap细胞悬液的吸光度(absorbance,OD490)值，计算各组LNCap细胞的抑制率=(1-实验孔测定值)/对照孔测定值×100%，实验3次，计算平均值。

1.2.3流式细胞术测定细胞凋亡率 收集按实验分组培养后的LNCap细胞消化离心，调整浓度为1×106/ml的单细胞悬液，离心，孵育缓冲液洗涤，离心后用标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15 min后离心，孵育缓冲液洗涤，加入荧光溶液4 ℃下避光孵育20 min。取100 μl上流式细胞仪，流式细胞仪激发光波长用488 nm，波长515 nm的通带滤器检测FITC荧光，波长>560 nm的滤器检测PI。检测分析各组细胞凋亡情况。

1.2.4甲基化特异性PCR(MSP)检测GSTP1启动子区的甲基化状态 通过测序验证：按试剂盒操作步骤，收集LNCap细胞，提取各组细胞的DNA，以重亚硫酸盐处理，将非甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶(C)不变。设计合成GSTP1甲基化(M) 与非甲基化(U) 引物。MSP反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳。同时采用MethyLight定量PCR法定量分析GSTP1甲基化水平，并以甲基化百分比参数表示。

1.2.5Real-time PCR检测GSTP1转录水平 收集各组LNCap 细胞，裂解细胞后，按TRIzol试剂盒操作步骤提取细胞总RNA，设计各基因引物序列，内参基因β-actin，逆转录盒合成cDNA，检测试剂盒检测GSTP1 mRNA的基因表达，采用2-ΔΔCt法计算其相对表达量。

1.2.6Western blot检测GSTP1蛋白水平 收集各分组LNCap细胞，裂解细胞后，取上清蛋白液，BCA盒测定分组细胞的蛋白含量。蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，结束后转膜，加入GSTP1一抗，孵育过夜，清洗后加入二抗，进行孵育。设置内参β-actin蛋白，分析GSTP1蛋白，蛋白相对表达量=目的蛋白条带积分吸光度值/β-actin蛋白条带积分吸光度值。

2 结果

2.1 槲皮素对LNCap细胞增殖能力的影响低、中、高浓度组细胞增殖抑制率随槲皮素浓度增加和时间的增长而升高，差异有统计学意义(均P<0.05)。对照组细胞增殖抑制率在12、24、36、48 h时间均高于低、中浓度组，在36、48 h时间中均低于高浓度组，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.2 槲皮素对LNCap细胞凋亡的影响低、中、高浓度组细胞凋亡率随槲皮素浓度增加而升高，差异有统计学意义(均P<0.05)。与对照组比较，低、中浓度组细胞凋亡率降低，高浓度组升高，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2，图1。

2.3 槲皮素对LNCap细胞中GSTP1启动子区甲基化影响结果显示，GSTP1基因在91 bp处出现甲基化条带，93 bp处出现非甲基化条带；在一定浓度范围内随着槲皮素浓度增加，LNCap细胞中GSTP1启动子区的甲基化程度减弱(P<0.05)，差异有统计学意义。见表3、图2。

表1 各组LNCap细胞增殖能力的情况

图1 流式细胞术检测结果

表2 各组LNCap细胞凋亡的情况

图2 各组LNCap细胞中GSTP1启动子区甲基化水平

表3 各组LNCap细胞中GSTP1启动子区甲基化水平

2.4 槲皮素对LNCap细胞中GSTP1表达的影响低、中、高浓度组GSTP1和GSTP1mRNA相对表达量随槲皮素浓度增加而升高，差异有统计学意义(均P<0.05)。与对照组比较，低、中、高浓度组GSTP1蛋白相对表达量降低，低、中浓度组GSTP1mRNA相对表达量降低，高浓度组GSTP1mRNA相对表达量升高，差异有统计学意义(均P<0.05)，结果见表4、图3。GSTP1甲基化水平与GSTP1和GSTP1mRNA表达水平呈负相关(r=-0.900、-0.836，均P<0.05)。

表4 各组LNCap细胞中GSTP1表达情况

图3 各组LNCap细胞中GSTP1蛋白表达

3 讨论

前列腺癌患者早期排尿困难，之后逐渐出现局部疼痛压迫症状，并向周围组织浸润[5]。在前列腺癌相关成纤维细胞中发现的DNA损伤修复基因沉默促进肿瘤进展[6]。GSTP1可主动保护细胞免受致癌物质和亲电子化合物的侵害。GSTP1的沉默会增加细胞中DNA损伤，人前列腺癌LNCaP细胞中GSTP1被抑制表达，基因沉默[7-8]。而GSTP1 DNA甲基化的基因沉默是前列腺癌发生和正常细胞发展为侵袭性癌的肿瘤进展的机制，可作为前列腺癌的诊断指标[9]。

对于谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GSTs)修饰的控制，活化的转录/翻译控制是保护细胞免受氧化应激和癌症发展伤害的重要机制[10-11]，笔者前期研究[12]研究表明，在人LNCaP细胞中减少GSTP1 CpG岛的21个CpG位点的甲基化，诱导GSTP1的mRNA表达和蛋白表达可有效抑制癌细胞的发展。槲皮素是一种存在于水果、蔬菜等天然植物中的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗感染、抗纤维化、抗肿瘤等作用[13]。众多研究表明[14-15]利用槲皮素联合化疗药物表现出抑制肿瘤生长和侵袭的作用，在肿瘤化学预防方面起着重要作用。

实验结果显示，在一定浓度范围内随着槲皮素用量增加，槲皮素可明显抑制LNCap细胞生长增殖，减弱GSTP1启动子区的甲基化程度；促进GSTP1mRNA和蛋白的表达，并对其有浓度依赖性。并且GSTP1 mRNA降低与GSTPl基因甲基化呈负相关。槲皮素可有效减弱LNCap启动子甲基化程度，抑制LNCap细胞的生长增殖。

然而，由于槲皮素生物利用度低，水溶性低及在体内被快速代谢和酶降解清除，严重阻碍了槲皮素在临床上的使用，因此，需要对槲皮素进行结构修饰，改善其水溶性及抗肿瘤活性。