IL-18调控血管平滑肌细胞TNF-α、IL-6、IL-8的表达

罗 欣，周 宏， 顾亚男，李名聪，李昱昊，张胜权

白细胞介素(interleukin，IL)-18是促炎症因子，位于人类基因11号染色体，一个24 ku的前体，被caspase1切割成18 ku[1]。单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞以及皮肤角质形成细胞均能表达IL-18。 18 ku的IL-18通过与靶细胞膜上特异性受体结合激活相应的信号途径而发挥作用[2]。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的主要原因[3]。一般认为脂质代谢障碍是AS的始动因素，其发病机制复杂，最近的研究[4]表明，多种炎症因子在AS发生发展中发挥着重要作用，此外也发现AS斑块中IL-18的表达水平较高，并且IL-18结合蛋白(interleukin 18 binding protein，IL-18BP)能够降低AS斑块形成风险[5-6]，提示IL-18在动脉硬化发病中可能发挥作用[6]。该研究通过探讨IL-18对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)炎症因子的表达影响，以期初步阐明IL-18在AS中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂由生化教研室陈兵老师惠赠的小鼠VSMC，转染了SV40大T抗原(SV40 large T antigen)后永生化的VSMC细胞株，10只8周龄SPF级C57BL/6小鼠，体质量20～25 g，雌雄不限。小鼠VSMC由该实验室保存。鼠IL-18购自美国PeproTech.公司；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；pp38、pAKT(1 ∶500)和β-actin(1 ∶1 000)抗体购自美国Cell signaling公司；逆转录试剂和RT-PCR试剂均购自日本TAKARA公司；ELISA试剂盒购自武汉贝茵莱生物科技有限公司；SB203580和LY294002购自美国Sigma公司；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 引物登陆NCBI网站检索甘油酸-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6、 IL-8基因序列(人，Primer Premier 5.0软件设计引物，见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 方法

1.3.1细胞培养 从液氮中复苏鼠VSMC,用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和链霉素 (100 mg/ml)的DMEM培养液置于37 ℃，5%CO2细胞培养箱培养。当细胞长到70%～80%时，以4×104/ml的密度接种于24孔细胞培养板。在实验前一天换无血清培养液。

1.3.2Real-time PCR检测TNF-α、IL-6、 IL-8的mRNA水平表达 在含有VSMC的24孔细胞培养板中分别加入不同浓度的IL-18(3、10、30、100 ng/ml)，继续培养12 h，加入TRIzol裂解细胞并提取总RNA；在另一块含有VSMC的24孔细胞培养板中分别于不同时间(2、6、12、18、24 h)加入IL-18(30 ng/ml)，最后加入TRIzol裂解细胞并提取总RNA，收取的样本按逆转录试剂盒说明合成cDNA，Real-time PCR扩增分析目的基因表达。PCR反应体系：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μl，ROX DYEⅡ0.4 μl，上下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 6.8 μl，总体积20 μl。在AB7500荧光定量分析仪上按程序运行，以GAPDH为内参。最后用相对定量分析法分析实验组与对照组。

1.3.3ELISA法分析TNF-α、IL-6、IL-8 蛋白水平表达 在含有VSMC的24孔细胞培养板中分别加入IL-18(30 ng/ml)，继续培养3 d，收集细胞上清液，按ELISA试剂盒说明书的方法分析VSMC上清液中的IL-6、 IL-8、 TNF-α蛋白的表达情况。

1.3.4Western blot分析IL-18的信号通路 在培养有VSMC的24孔细胞培养板中分别采取不同时间(10、30、60、120 min)加入IL-18(30 ng/ml)，用细胞裂解液裂解细胞提取24孔板上总蛋白；在另一块培养有VSMC的24孔细胞培养板中分别加入SB203580 (10 μmol/L，p38MAPK抑制剂)和LY294002(50 μmol/L, PI3K抑制剂)，1h后再加入IL-18(30 ng/ml)，继续培养1 h，用细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白。收集的蛋白用12%SDS-丙烯酰胺凝胶为分离胶，10 μg蛋白上样，浓缩胶中60 V电泳，当蛋白进入分离胶后，100 V继续电泳；将蛋白转至PVDF膜上(恒流200 mA，3 h)。5%脱脂牛奶封闭2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min，敷一抗4 ℃过夜，敷二抗2 h，用ECL发光剂压胶片发光显影。

2 结果

2.1 IL-18对VSMC细胞中TNF-α、IL-6、 IL-8的mRNA水平表达的影响Real-time PCR检测的结果显示IL-18能促使VSMC中TNF-α、IL-6、 IL-8的mRNA水平表达量增加，并且与IL-18的浓度成正相关，与对照组(0 ng/ml)比较差异有统计学意义(P<0.05，F=48.372)；IL-18(30 ng/ml)能够促使VSMC中TNF-α、IL-6、 IL-8的mRNA水平表达增加，且24 h内表达量与时间成正相关，与对照组(0 h)比较差异有统计学意义(P<0.05，F=71.678)。即TNF-α、IL-6、 IL-8的mRNA水平表达量与IL-18具有剂量和时间依赖性，见图1。

图1 Real-time PCR检测细胞因子表达

2.2 IL-18对VSMC细胞中TNF-α、IL-6、 IL-8的蛋白水平表达的影响ELISA法的结果分析显示IL-18能够显著增加VSMC上清液中TNF-α、IL-6、 IL-8的蛋白水平的表达，且与对照组(0 ng/ml)比较差异有统计学意义(P<0.05，FTNF-α=74.008，FIL-6=274.065，FIL-8=168.253)，见图2。

2.3 IL-18对VSMC细胞中p38MAPK及PI3K/AKT信号通路的影响Western blot的结果分析显示IL-18能够增加VSMC细胞中pp38MAPK及pAKT的水平，其峰值分别在60 min及120 min(图3A)。

图2 IL-18增加VSMC细胞中TNF-α、IL-6、 IL-8的蛋白水平表达

图3 Western blot分析pp38MAPK及pAKT水平

2.4 IL-18刺激VSMC后TNF-α、IL-6、 IL-8的蛋白的表达水平与p38MAPK及AKT信号通路相关性为了进一步探讨IL-18增加TNF-α、IL-6、 IL-8的表达是否与p38MAPK及PI3K/AKT信号途径激活激活相关，特异性抑制剂SB203580及LY294002处理VSMC细胞并分析其对IL-18诱导细胞因子表达的影响。图3B、C结果显示，SB203580及LY294002分别特异性部分阻断IL-18激活的p38MAPK及PI3K/AKT信号途径。特异性抑制剂SB203580能部分阻断IL-18诱导的TNF-α、IL-6、IL-8表达，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05，FTNF-α=104.418，FIL-6=62.113，FIL-8=126.524)；特异性抑制剂LY294002能部分阻断IL-18诱导的TNF-α、IL-6、IL-8表达，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05，FTNF-α=94.658，FIL-6=75.382，FIL-8=56.970),见图4。

图4 SB203580及LY294002分别特异性阻断IL-18诱导的TNF-α、IL-6、 IL-8表达

3 讨论

AS是心脑血管疾病的主要原因。多年来的研究[7-8]表明，高胆固醇及高低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)是AS原因之一。目前认为动脉硬化的发病过程：过多的脂质成分沉积在主动脉内膜，氧化或糖化的LDL诱导血管壁细胞产生趋化因子，趋化因子诱导免疫细胞局部聚集，尤其是巨噬细胞。巨噬细胞摄入氧化的LDL形成泡沫细胞进而形成脂质条纹，进一步的脂质沉积和免疫细胞浸润形成AS斑块(包括脂质、泡沫细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)[4]。研究证明天然和获得性免疫在AS的发生发展中都起作用。一系列细胞因子参与了其发展过程。天然免疫和炎症小体活化，尤其是NOD样受体家族3(NLRP3)和IL-1β在AS早期发展中发挥重要作用， 胆固醇在动脉硬化斑块沉积活化NLRP3， 然后诱导IL-1β和IL-18释放[9]。IL-18和IL-18Rα在硬化斑块的细胞中高表达。研究[ 10-12]发现 IL-18能够进一步刺激其他细胞释放炎症因子，包括IFNγ、IL-6等，而IL-18BP 能够阻止动脉硬化斑块的形成。本研究显示，IL-18体外诱导VSMC中TNF-α、IL-6、 IL-8的表达，提示AS斑块中的细胞因子不仅仅来自免疫细胞，VSMC也表达炎症因子。此外，这些炎症因子还调控内皮细胞及平滑肌细胞的增殖和凋亡，进而参与了AS斑块的发生发展[13]。这一结果说明了IL-18可以通过影响VSMC表达炎症因子产生的次级效应而发挥作用，同时通过阻断IL-18可能成为防治AS的新途径。

进一步的机制研究表明IL-18能够激活VSMC中p38和PI3K/AKT信号通路，提示IL-18参与了AS中炎症因子激活的信号途径网络并产生协同效应。细胞的信号通路有很多，调控及相互作用极其复杂。研究[14]发现IL-18能够激活p38、 ERK1/2 MAPKs、 STAT3 和 NF-κB 等信号途径。此外，研究[15]发现用IL-18处理小鼠皮层神经元发现：IL-18通过增强PI3K和磷酸化AKT的水平，激活了PI3K/AKT通路,并进而激活其下游的NF-κ B。本研究显示IL-18激活VSMC细胞的P38和AKT信号通路通路，并进而分析其对炎症因子表达的影响。但是，IL-18对VSMC的调控可能还涉及到其他信号通路及调控其他细胞因子的表达、以及对细胞的增殖和凋亡的影响，这些问题均有待进一步研究。

综上， IL-18体外增加VSMC中TNF-α、IL-6、 IL-8 3种炎症因子表达，其机制部分依赖p38和PI3K/AKT信号通路的活化。该结果可能有助于阐明IL-18在AS发生发展中的部分作用机制，为寻找AS新的防治措施奠定基础。