酒酒球菌在葡萄酒中的应用研究进展

侯冬冬，刘朋，赵祥忠，姚艳艳，何熹*

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院，山东 济南 250353；2.国家海产贝类工程技术研究中心，山东 威海 264316）

葡萄酒的酿造是一个复杂的过程，涉及不同微生物的相互作用，其中主要包括酿酒酵母和乳酸菌。酿酒酵母主要负责酒精发酵，可以将葡萄汁中的糖转化为酒精和CO2，是葡萄酒香气物质形成的主要时期[1]。苹果酸-乳酸发酵通常在酒精发酵期间或酒精发酵结束时进行，由一种或多种乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）启动并进行[2]。其能够降低葡萄酒的酸度，并且有利于提高微生物的稳定，乳酸菌的次级代谢产物还能够极大地丰富葡萄酒的香气，提高感官特性[3-4]。在所有乳酸菌品种中，酒酒球菌既能适应恶劣的葡萄酒环境，又能通过苹果酸-乳酸发酵改善葡萄酒口感，因此是商业葡萄酒发酵剂的代表菌株。

由于酒酒球菌在葡萄酒酿造中的重要地位，越来越多的研究者对酒酒球菌做了相关研究。在研究初期，通过对我国葡萄酒主产区的乳酸菌进行分离和鉴定，从中筛选出了酿酒适应性和酿酒特性优良的菌株[5]。进一步研究发现，酒酒球菌能够在复杂的葡萄酒环境中生存，其产生的次级代谢物能够提高葡萄酒的品质和改善风味[6]。虽然酒酒球菌能够耐受环境中葡萄酒发酵中的乙醇、SO2等不利条件，但是葡萄酒中存在的各种因素，都有可能制约着酒酒球菌的生长繁殖和代谢[7]。全面认识酒酒球菌在葡萄酒酿造中的作用有利于更好地调控葡萄酒苹乳发酵，从而进一步提高其在葡萄酒酿造中的应用。

1 酒酒球菌的分离筛选和鉴定

在葡萄酒酿造中启动并参与苹果酸-乳酸发酵（简称苹乳发酵）的乳酸菌被称为葡萄酒乳酸菌，目前研究结果发现主要有4个属，分别为乳杆菌属（Lactobacillus beijerinck）、明串珠球菌属（Leuconostoe mesenteroides）、片球菌属（Pediococcus blaussen）以及酒球菌属（Oenococcus）[5]。在所有的苹乳发酵菌株中，酒酒球菌表现出优良的酿酒风味特性，对提升葡萄酒品质有着积极作用，因此商业乳酸菌主要以酒酒球菌为主导者。植物乳杆菌也是发酵过程中一种常见的菌种，可以作为苹乳发酵的启动菌。有相关研究表明植物乳杆菌会在苹乳发酵过程中产生生物胺等不良次级代谢物，使酒产生鼠臭味影响葡萄酒的品质和香气[8]。因此，分离筛选和鉴定出具有优良酿酒适应性和酿酒特性的酒酒球菌，对于提高葡萄酒二次发酵品质具有重大意义。

1.1 酒酒球菌的分离筛选

酒酒球菌是一种营养缺陷型菌株，绝大多数菌株缺乏烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，需要在添加番茄汁生长因子的培养基中才能够生长[5]。目前我们所采用的酒酒球菌分离培养基为番茄汁培养基。为了提高酒酒球菌的鉴别能力，一般还会添加放线菌酮50 mg/L、万古霉素50 mg/L（放线菌酮能有效地抑制酵母菌和霉菌的生长，万古霉素能够抑制其他乳酸菌）。通过添加这两种抗生素，可以分离得到原存在于葡萄酒中的酒酒球菌[9-10]。

1.2 酒酒球菌的鉴定

对分离得到的酒酒球菌一般会先采用生化鉴定，主要从菌株的形态特征（细胞球型至椭圆型，常成对和链形排列，直径通常小于1 μm）、生理生化特征（革兰氏阳性菌，能够分解苹果酸）等方面进行分类区别[11]。生化鉴定法作为一种基础鉴定方法，虽然操作简单，但过程会相对复杂，耗时长，结果也会有差异性。随着科学技术不断发展，分子技术不断推陈出新，特别是在物种鉴定方面，逐渐形成快速准确的方法。目前的分子鉴定方法一般为16SrRNA、分子标记、扩增核糖体DNA限制性分析和多位点序列分析[12]。我国葡萄种植和葡萄酒酿造地域性差距大，分离筛选和鉴定出本土优质的酒酒球菌菌种，对我国葡萄酒产业发展具有推动作用。

2 酒酒球菌对葡萄酒酿造的作用

酒酒球菌是目前公认的能够较快适应葡萄酒酒精发酵之后恶劣环境的一类乳酸菌，如低pH值、高SO2浓度和高乙醇体积分数[13]，能够对葡萄酒苹乳发酵起到启动和执行的作用。苹乳发酵主要指葡萄酒中苹果酸通过酒酒球菌作用转化为乳酸的过程。在此过程中能够提高葡萄酒pH值，一般被认为是葡萄酒的生物降酸过程[14]。此外，酒酒球菌在发酵过程中还会产生许多次级代谢物，一部分为自身的生长和繁殖提供能量和营养，另一部分能在一定程度上赋予葡萄酒丰富的香气[5]。此过程对于提高葡萄酒品质的意义在于提高葡萄酒生物稳定性、降低色度、增加香气复杂度、提高葡萄酒品质和改善口感[15]。

2.1 提高葡萄酒生物稳定性

葡萄酒是葡萄汁经过发酵形成的产物。酵母通过酒精发酵将绝大多数的营养物质消耗掉，这一过程会产生大量有机酸，其中苹果酸容易被多种微生物利用，因而会使葡萄酒在贮存过程中腐败。在苹乳发酵过程中，酒酒球菌对苹果酸具有独特的分解作用，同时也会消耗其他营养物质，从而减少其他有害微生物的产生，经过这一过程，可以提高葡萄酒生物稳定性，有益于延长葡萄酒贮存时间[16]。

2.2 降低葡萄酒色度

葡萄酒的颜色是判断葡萄酒品质的一个重要标准，其颜色的形成主要与葡萄品种和陈酿有关，主要成分为花色苷。参与苹乳发酵的酒酒球菌可以利用与SO2结合的物质如α-酮戊二酸、丙酮酸等，可以释放出SO2[17]。处于游离状态的SO2可以与花色苷结合，从而减少葡萄酒中的显色物质[18]，经过这一过程可以使葡萄酒的颜色更加具有观赏性。

2.3 增加葡萄酒香气复杂度

随着葡萄酒酸度的降低，会使酒的口味变得柔和圆润。酒酒球菌在将苹果酸转化为乳酸的同时也会产生一些次级代谢物，比如双乙酰、乙偶姻、2，3-丁二醇及其它优良的风味物质，这些都是对葡萄酒有利的物质，能够增加葡萄酒香气的丰满性和复杂度[19]。

2.4 提高葡萄酒品质改善口感

酸类物质是葡萄酒的主要成分，其组成和含量直接和间接影响着葡萄酒的品质[20]。葡萄酒中的有机酸主要是苹果酸和酒石酸，其中苹果酸给人的感官特征为尖锐且带有涩感，不太容易被人接受[21]。经过酒酒球菌转化为乳酸，乳酸口感柔和顺口，没有涩感[22]。因此，能够在提高葡萄酒品质的同时改善口感，让更多的人群接受。这使得酒酒球菌在葡萄酒后期香气形成中有着独特的作用。

2.5 酒酒球菌可能引起的潜在质量风险

相关研究表明，当葡萄酒苹乳发酵结束后不立即采取中止措施，酒酒球菌可会转化为病原菌，引发葡萄酒病害，如酒石酸发酵病、乳酸发酵病、乳酸性酸败等[23]。因此在进行苹乳发酵时，检测苹果酸和乳酸的含量是十分有必要的，严格的工艺流程也是生产出优质葡萄酒的先决条件。

3 葡萄酒酿造过程对酒酒球菌的影响

酒酒球菌独特的酿酒特性会影响其生长的环境，即对葡萄酒品质的影响[12]。而在这一过程中，葡萄酒的自身环境同样是制约着酒酒球菌的生长的关键因素。除此之外，不同的酿酒工艺，如酒酒球菌不同的接种量和接种时间也会影响其生长。酒精发酵后残留的酵母菌，以及其他乳酸菌菌群，彼此之间的相互作用同样会对酒酒球菌有影响[24]。

3.1 环境因素对酒酒球菌的影响

酒精发酵结束后，葡萄酒处于比较恶劣的环境：低pH值、高酒精度、高SO2浓度等，这些因素很大程度上影响了酒酒球菌的生存和生长[25-26]。pH值越低，对酒酒球菌的抑制效果越明显，会阻碍苹乳发酵的启动。酒精是酒酒球菌在葡萄酒中生长的主要抑制因子，高含量乙醇能影响细胞膜流动性，会阻碍酒酒球菌生长[27]。溶解氧不仅不利于酒酒球菌生长，还会使醋酸菌等有害微生物大量繁殖，乙酸、双乙酰等不良产物含量上升，使葡萄酒败坏[28]。SO2在葡萄酒酿造过程中起到抗氧化、抑制野生酵母和腐败菌生长的作用，但它对酒酒球菌也会有一定的抑制作用，当浓度大于100 mg/L时，酒酒球菌将会完全被抑制，无法生长[29]。研究表明：酒酒球菌能够在pH值不低于3.2、酒精度10%vol～14%vol、总SO2浓度不超过50 mg/L条件下正常生长[26]。

3.2 不同接种量和接种时间的影响

酒酒球菌不同的接种量会影响苹乳发酵的速度，从而影响葡萄酒中挥发酸的含量和葡萄酒的色泽。不同的酒酒球菌发酵特性不同，在使用前应进行接种量试验，选择最佳接种量有利于苹乳发酵的顺利进行[30]。同时接种时间对苹乳发酵的启动和保持菌种活性同样重要。通常有以下3种接种时间安排：混合接种（在酒精发酵启动时与酵母同时接种），过程接种（在酒精发酵过程中接种），顺序接种（酒精发酵结束后接种），接种时间会影响接种后酒酒球菌的成活率和延滞期的长短[31]。混合接种和过程接种会在一定程度上影响酒精发酵，对于葡萄酒香气物质的形成存在不可控性。因此，目前在葡萄酒酿造中都是采用顺序接种。

3.3 微生物间相互作用

酵母菌和酒酒球菌有一定的抑制作用。首先，酒酒球菌能产生分解酵母菌细胞壁的β-1，3葡聚糖酶[32]；其次，酵母菌会产生抑制肽、酒精和中链脂肪酸，它们在一定的浓度下也会抑制酒酒球菌的生长[33]。葡萄酒在酒精发酵结束后，存在一些酵母没有利用完的营养物质，同时酵母菌自溶会释放蛋白质等大分子化合物[34]。此时，葡萄酒中存在的乳酸菌群体就会相互竞争这些营养物质，其中植物乳杆菌和戊糖片球菌会产生一些短肽和蛋白质，会对酒酒球菌有强烈的抑制作用，虽然会造成酒酒球菌生长速率降低，但是对其并没有致死作用[35]。希氏乳杆菌也会和酒酒球菌竞争氮源和多肽，会产生一种互害共栖的关系[36]。在葡萄酒酿造时，可以通过人工添加酒酒球菌的方式，有利于苹乳发酵的进行。

4 酒酒球菌分子生物学研究

分子生物学是从分子水平上阐明遗传、生殖、生长和发育等生命特征的分子机理，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新手段。长期以来，人们利用这一技术对酒酒球菌也进行了深入研究，现阶段对其的研究主要集中在以下几个方面：种类鉴定、遗传图谱构建、全基因组测序、种群遗传学、抗胁迫性分子机理及调控等[37-38]。

通过酒酒球菌完整基因组序列，可以预测其生理学特性，并且验证相关基因在酿酒中的功能。其中苹乳发酵启动的相关基因mleA（苹果酸乳酸酶基因）及mleP（苹果酸转运蛋白基因）研究比较多，一般都会将这两个基因外源表达在酵母中，虽然这样能够使酵母同时具备启动苹乳发酵载体的功能，但苹乳发酵还会涉及其他物质的代谢，是酵母无法替代的[39-40]。因此，如果利用分子生物学技术对酒酒球菌进行改造，有利于更高效的进行苹乳发酵启动，同时酒酒球菌本身也会赋予葡萄酒更加丰富的香气成分。可是目前由于酒酒球菌具有生长缓慢，不易培养等特点，同时又缺乏相关的载体，因此对其进行转化存在相当大的困难。

5 结语

酒酒球菌作为葡萄酒苹乳发酵的启动者和执行者，优良菌株的筛选及其酿酒特性一直是人们的研究重点。优良酒酒球菌能够代谢苹果酸、糖、含氮物质等，产生的次级代谢物能够丰富葡萄酒风味，提高葡萄酒感官品评。酒酒球菌在复杂的葡萄酒环境中，每一个因素都能影响其生长繁殖和代谢，各个因素作用机制尚不明确，这些因素对酒酒球菌的作用机理还有待研究。酒酒球菌工程菌株构建一直还未明了，如果将有利于葡萄酒香气的相关基因表达到酒酒球菌中，能够在葡萄酒发酵的最后阶段对其香气的形成有很好的塑造作用。因此，未来对酒酒球菌的作用机理研究和工程菌株的构建将是其研究重点。