纸基微流控器件法检测丙氨酸氨基转移酶的研究

孙来玉, 钱 坤, 赵明星, 肖 莉

(湖州师范学院 生命科学学院，浙江 湖州 313000)

丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)不仅是肝脏疾病敏感可靠的指标，还对全身性疾病，特别是肥胖、代谢综合征和心血管疾病有较高的预测价值[1-2].常规体检、乙肝病毒携带者的ALT医学跟踪、献血者ALT的筛检、药物性肝损伤诊断都离不开对ALT的快速准确检测，尤其在基层医院和欠发达地区更需要准确便捷的ALT检测方法.国内外报道检测ALT的方法颇多，主要有干式法、赖氏法、微孔板速率法和全自动生化速率法[3-6].干式法的试纸条不仅可以测定血清，还可以对血浆和全血标本进行测定，排除溶血和脂肪血对结果的干扰性能较高，但干氏法的临界值较高，一般为40 U/L，只能作定性或半定量检测.赖氏法成本低，操作简便，不需要特殊试剂和仪器，在临床上应用广泛，但缺点是耗时长、准确性差、有化学试剂污染等.微孔板速率法具有试剂用量小、能用酶标仪比色、操作简单、检测速度快的优点，其缺点是操作误差较大、酶的底物浓度消耗较快、线性范围窄.全自动生化速率法准确、快速，能成批检测，是目前临床生化检测常用的方法，其缺点是单个样本检测速度不快、操作较复杂、仪器体积较大、价格昂贵和有化学试剂污染等.近年来，以微阵列和微流控等为代表的高通量、微型化分析技术发展迅猛，是检测生物大分子和化学小分子的有力工具[8-11].纸基微流控器件(paper-based microfluidic analytical devices，μPADs)是一种最简单的芯片实验室技术，具有成本低、加工简易、使用和携带方便等优点，在临床诊断、食品营养与安全和环境监测等领域具有较大的应用前景.

本文利用丙氨酸在ALT作用下转化为丙酮酸，经丙酮酸氧化酶催化产生过氧化氢，借助辣根过氧化酶催化Luminol-H2O2化学发光反应，建立纸基微流控器件，通过发光强度检测待测品中ALT的活性含量.该器件自动化程度高、检测快速、灵敏度高、携带方便、样品用量少，适用于大规模样品的检测.

1 材料与方法

1.1 材料

硝酸纤维素膜(NC,Whatman)、层析纸(Whatman)、辣根过氧化酶(HRP,CanAg Co.,Ltd)、丙氨酸氨基转移酶(ALT,Sigma)、化学发光AB检测液(Luminol-H2O2,Pierce)、丙氨酸(Sigma)、丙酮酸氧化酶(上海源叶生物公司)、血红蛋白(Sigma Aldrich)、丙酮酸(国药集团)、抗坏血酸(国药集团)、葡萄糖(国药集团)、尿素(国药集团)、肌酐(国药集团)、芯片阅读仪(HK-2001A,上海数康生物科技有限公司)、打印机(Xerox 8560DN).

1.2 方法

1.2.1纸基微流控器件的制作

纸基微流控器件的制作如图1所示.1号膜和5号膜为透明压膜，1号膜有一直径3 mm的加样孔；2号膜为NC膜(孔径为0.22 μm，用于过滤样品)；3号膜为Whatman层析纸，上面印有4个小圆圈，圈外涂蜡，圈内加3 μL 0.5 mol/L丙氨酸溶液,阴干,再依次滴加3 μL 10 mmol/L鲁米诺、50 U/mL丙酮酸氧化酶溶液；4号膜印有与3号膜一样的小圆圈，圈内滴加3 μL 0.1 mg/mL辣根过氧化酶，阴干.将1、2、3、4和5号膜按图1装配并压膜，备用.

1.2.2 检出限与定量限

用人工血浆缓冲液将ALT溶液逐级稀释，加入30 μL稀释液至器件加样孔中使反应的S/N(信噪比)为3和10，以考查器件ALT的检出限和定量限.

1.2.3 线性范围

分别将含0、5、10、20、40、80、160、320 U/L ALT的样品30 μL加入到器件加样孔中反应,考查ALT浓度-光信号之间关系.

1.2.4 回收试验

用人工血浆缓冲液稀释制备20、40、60 U/L ALT 3个不同浓度的试样，各测定6次，统计回收率.

1.2.5 精密度测试

抽取3批纸基器件读取8个微阵列信号，以40 U/L ALT为质控品，考查器件批内和批间的信号精密度.

1.2.6 干扰性试验

用人工血浆缓冲液系列稀释配制血红蛋白、丙酮酸、抗坏血酸、葡萄糖、尿素和肌酐溶液作为待测品，考查这6种物质对检测结果的影响.使ALT的终浓度为40 U/L，血红蛋白的浓度梯度为0、5、10、20、50、100、250、500 mg/dL；丙酮酸的浓度梯度为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L；抗坏血酸的浓度梯度为0、0.5、1、2、4、6、8、10 mg/dL；葡萄糖的浓度梯度为0、50、100、200、400、600、800、1 000 mg/dL；尿素浓度梯度为0、5、10、20、40、60、80、100 mg/dL；肌酐的浓度梯度为0、0.5、1、2、5、10、15、20 mg/dL.取30 μL待测品加入到纸基器件上检测，比较光子信号的变化趋势.

1.2.7 器件稳定性试验

将相同批次的30块器件分成两组，以40 U/L ALT为质控品考查器件的贮存稳定性.第一组15块器件贮存于37 ℃药品稳定试验箱中，每天检测1次器件的信号值；第二组15块器件贮存于2～8 ℃冰箱中，每30天检测1次器件的信号值.

2 结果与分析

2.1 检出限与定量限

S/N分别为3和10时，ALT检测的检出限和定量限分别为2 U/L、6 U/L.

2.2 线性范围

ALT浓度-光子信号关系如图2所示，ALT的活性浓度与光子信号的关系呈正相关，在5～ 80 U/L浓度范围内呈线性,其拟合方程为：

Y=-0.002 5X3+0.234 5X2+22.448X+17.463，R2=0.999 3.

2.3 回收试验

回收试验结果见表1，回收率在94.0%～102.4%范围内.

表1 回收试验结果Tab.1 The results of recovery test

表1(续)

2.4 精密度

精密度检测结果见表2.表2中3批器件批内和批间的CV值均小于5.0%，批间CV值大于批内CV值.

表2 纸基器件信号的精密度Tab.2 Signal precision of paper-based devices

2.5 干扰性试验

干扰性试验结果见图3至图8.由图3和图4可知，血红蛋白、丙酮酸使检测结果偏大；由图5可知，抗坏血酸使检测结果偏小；由图6至图8可知，葡萄糖、尿素和肌酐对检测结果无明显影响.

2.6 器件稳定性试验

器件的存储条件、时间与器件的信号关系见图9.在37 ℃药品稳定试验箱中，器件上的分子容易失去分子识别活性；贮存于2～8 ℃冰箱中，器件上的分子在12个月内基本保持分子识别活性.

3 讨 论

3.1 质控品浓度的选取

ALT主要存在于各种细胞中，尤以肝细胞内最多.正常时，只将少量ALT释放入血中，血清中其酶的活性即可明显升高.在各种病毒性肝炎的急性期、药物中毒性肝细胞坏死时，ALT大量释放入血中，因此它是诊断病毒性肝炎、中毒性肝炎的重要指标.临床上ALT的正常参考值为0～40 U/L，因此将待测品检测信号与40 U/L质控品进行比对有直接参考意义.此外，由ALT的浓度-光子信号关系可知，样品中ALT的浓度为40 U/L时，光子信号大小适中，并处于线性范围的中段，这有利于考查器件的性能，因此本文选择40 U/L ALT作为质控品.

3.2 检测条件

在检测过程中加入30 μL样品于器件加样孔中，该加样体积是预实验得出的条件，如加样体积少于20 μL，则不能充分润湿反应区域，且会使检测结果产生较大偏差甚至错误；如加样体积多于60 μL，则会产生液体溢出加样孔的情况.因此选用30 μL的加样体积较合适.预实验表明，温度为37～40 ℃时，反应较迅速，当加样阵列较多时，则加样时间较长，这使器件上的试剂损耗较多，不利于芯片阅读；反应温度低于15 ℃，则酶促反应速度较慢，也不利于芯片阅读.因此选择室温反应60 s.在芯片阅读仪中阅读积分60 s等时间参数是与反应温度相关联的.

3.3 干扰试验

血液中代谢物质有很多种，这些物质的异常升高或积累有可能对检测结果产生影响，如丙酮酸是器件中丙酮酸氧化酶的底物，如血清中含有较多的丙酮酸，则会产生结果偏大的情况.因为人群的复杂性，血液中化学成分差异较大，本研究只考察了血红蛋白、丙酮酸、抗坏血酸、葡萄糖、尿素和肌酐6种物质对实验的影响，其他诸如胆红素、胆固醇等潜在干扰物质的干扰情况需要进一步研究.

4 结 论

利用丙氨酸在ALT作用下转化为丙酮酸，经丙酮酸氧化酶催化产生过氧化氢，借助HRP催化Luminol-H2O2化学发光反应 ，建立纸基微流控器件，通过发光强度检测待测品中ALT的活性含量,并通过一系列实验考查了器件的检测限、线性范围、回收率、信号精密度、潜在干扰物质和储存稳定性.结果发现：以40 U/L ALT为质控品、加样体积为30 mL、室温反应60 s、在芯片阅读仪中阅读积分60 s，器件信号检测较稳定；器件贮存于2～8 ℃冰箱中，光子信号在12个月内基本稳定.因此，采用该方法检测血清中丙氨酸氨基转移酶快速、简单、准确.本文的不足之处是只研究了血红蛋白、丙酮酸、抗坏血酸、葡萄糖、尿素和肌酐等6种物质对该器件检测结果的影响，由于人群个体的复杂性，血液中化学成分差异较大，诸如胆红素、胆固醇等潜在干扰物质对器件检测的影响需要进一步研究.