添加褪黑素对湖羊精液冷冻保存效果的影响

2021-01-12郭良勇周俊波吴建良赵永祥彭彩娥潘异哲

湖州师范学院学报 2020年10期

郭良勇，周俊波，曹访，吴建良，赵永祥，彭彩娥，潘异哲

(1.湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州 313000； 2.湖州市农业科学研究院湖羊研究所，浙江湖州 313000；3.浙江省农业科学院畜牧兽医所，浙江杭州 310021； 4.湖州市动物疫病预防控制中心，浙江湖州 313000)

褪黑素(melatonin，MLT)是一种由松果腺合成和分泌的神经内分泌激素.有关研究证明，褪黑素和代谢衍生物可调节抗氧化酶的活性，减少对脂质、蛋白质和DNA抗氧化的损伤[1].褪黑素可以提高精子顶体、质膜和DNA完整性，降低膜脂质过氧化作用，调节精子获能过程[2].目前，褪黑素在关于动物精液冷冻保存领域已开展相关研究.霍敏等[3]证实在绒山羊精液冷冻稀释液中添加0.5 mg/mL褪黑素能显著提高绒山羊精子的抗氧化能力和冷冻保存效果.杨宝卫等[4]发现10 mmol/L褪黑素可以有效改善冷冻后猪精子的畸形率和顶体完整率.李晓霞等[1]在牛精液稀释液中添加10-3mmol/L褪黑素可明显改善牛精液品质，提高牛精液的保存时间和保存质量.这些研究都证实褪黑素对动物精液保存质量具有一定的促进作用.

湖羊是我国国家级畜禽资源保护的绵羊品种，主要养殖于太湖流域，具有独特的波浪形羔皮、一胎多羔、生长速度快等优良性[5].目前关于褪黑素在湖羊精液低温保存中的应用少见报道.本研究通过比较不同浓度褪黑素对湖羊精液冷冻解冻后的精子活力、顶体完整率，以及精浆中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量的影响，筛选出褪黑素最适合的添加浓度，为湖羊精液冷冻保存技术的广泛应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验精液

选择湖州市农业科学研究院湖羊试验场5只健康、繁殖性能良好的湖羊种公羊，年龄为2～3周岁，采用假阴道法采集鲜精.将收集到的精液置于37 ℃水浴中保存，1 h内带回实验室进行活力检测，选择精子活力0.8以上的精液用于冷冻保存.

1.2 药品与试剂

褪黑素、果糖、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、甘油购自Sigma公司；丙二醛(MDA)试剂盒、谷胱甘肽(GSH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；新鲜鸡蛋购自超市，用于取得卵黄.

1.3 试验仪器

冰箱(型号为BCD-320WTPMA)，美的公司生产；水浴锅(型号为DK-S28)，上海精宏实验设备有限公司生产；电子天平(型号为JD2000-3)，沈阳天平仪器厂生产；荧光显微镜(型号为BA210 Digital)，麦克奥迪集团有限公司生产；紫外分光光度计(型号为BioSpectrometer)，艾本德中国有限公司生产.

1.4 基础冷冻稀释液配置

基础冷冻稀释液的配制参照配方[6]：果糖5 g/L、三羟甲基氨基甲烷30.63 g/L、柠檬酸19.9 g/L，添加20%蛋黄、5%甘油.

1.5 试验设计与分组

将新鲜精液在室温中静置30 min，然后以基础冷冻稀释液分2步等比例稀释至4倍，加入褪黑素，按褪黑素的不同终浓度(10、20、30 mg/mL)设为试验1组、试验2组、试验3组，以不添加褪黑素为对照组.

1.6 精液冷冻与解冻

将稀释好的精液置于4 ℃冰箱中缓慢降温，1.5 h后在4 ℃条件下分装至0.25 mL细管中平衡2 h，然后在距液氮面4 cm处熏蒸10 min，熏蒸结束后迅速将细管投入液氮中冷冻保存.2周后取出冷冻细管，39 ℃水浴解冻20 s，然后进行相关检测.

1.7 精液品质检测

(1) 精子常规指标：细管冻精解冻后，利用计算机辅助精液分析系统检测精子活力；使用姬姆萨染料对精子进行染色后镜检，检测精子顶体完整率.检测全程须避光操作.

(2) 精子生化指标：使用相应的试剂盒对冻精解冻后精浆中的GSH、MDA进行检测，其中GSH检测依据二硫代二硝基甲酸比色法，比色波长为420 nm；MDA检测依据硫代巴比妥酸比色法原理，比色波长为532 nm.以上检测的相关操作严格按照南京建成生物工作有限公司试剂盒说明书要求进行.

1.8 数据的统计分析

所有试验测得的数据经Excel软件整理，然后用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著.

2 结果与分析

2.1 褪黑素对湖羊精液冷冻解冻后精子活力的影响

由图1可知，在冷冻稀释液中添加20 mg/mL褪黑素，试验2组得出的结果是：湖羊冻精解冻后的精子活力最高，为0.432，显著高于对照组的0.395(P<0.05)；试验1组和试验3组得出的结果是：湖羊冻精解冻后精子活力与对照组相比差异不显著(P>0.05).

2.2 褪黑素对湖羊精液冷冻解冻后精子顶体完整率的影响

由图2可知，冷冻稀释液中添加20 mg/mL的褪黑素后，试验2组得出的结果是：湖羊精液冷冻解冻后精子顶体完整率最高，为0.512，极显著高于对照组、试验1组和试验3组(P<0.01)；对照组、试验1组和试验3组得出的结果是：湖羊精液冷冻解冻后各组精子的顶体完整率差异不显著(P>0.05).

2.3 褪黑素对湖羊精液冷冻解冻后精浆中MDA含量的影响

由图3可知，湖羊精液冷冻解冻后各组精浆中的MDA含量存在极显著差异(P<0.01)，添加褪黑素各试验组精浆中的MDA含量极显著低于对照组，为1 082 nmol/L(P<0.01)，且试验2组精浆中的MDA含量最低，极显著低于试验1组和3组(P<0.01).

2.4 褪黑素对湖羊精液冷冻解冻后精浆中GSH含量的影响

由图4可知，湖羊精液冻精解冻后，各组精浆中GSH含量存在极显著差异(P<0.01)，试验2组精浆中GSH含量最高，为167.5 μmol/L，极显著高于对照组、试验1组和试验3组(P<0.01)，且试验1组和试验3组精浆中的GSH含量极显著低于对照组(P<0.01).

3 讨论

3.1 褪黑素对精子活力的影响

在动物精液的冷冻保存过程中，精液的稀释、冷冻、解冻等处理不可避免地产生包括活性氧(ROS)在内的各种自由基[7]，对精子结构和遗传物质的稳定性造成不可逆的损伤.研究表明，活性氧(ROS)是造成精子过氧化损伤最常见的因素[8]，其过氧化作用可引起精子膜结构与功能的改变，还可引起精子线粒体和DNA损伤[9]，导致精子保存质量急剧下降.线粒体是ROS形成的主要场所，ROS会导致电子传递链的中断，从而降低精子活力，发生脂质过氧化反应.本研究中添加20 mg/mL褪黑素可显著提高湖羊精液冷冻解冻后的精子活力，这可能与褪黑素是一种能清除ROS的外源性非酶抗氧化剂，对不同类型细胞都有抗氧化和抗凋亡作用[10-11]有关.杜少银等[12]、李博玲等[13]证实将褪黑素作为外源性抗氧化剂的补充物，可显著减少猪精液稀释保存过程中产生的ROS水平.梁岚[14]发现低浓度褪黑素可以促进抗凋亡蛋白Bcl2的表达，从而使精子得以长时间存活.在动物精液保存的研究中Rodriguez-Osorio等[15]将10-3mol/L浓度的褪黑素添加到公羊精液冷冻扩增剂中，发现可以提高精子的活力、运动参数、细胞内ATP浓度和DNA完整性，明显减轻低温保存期间的精子损伤.王淑娟等[16]发现添加10-7mol/L褪黑素可提高公猪精子的运动性、活力、存活率、膜完整性和线粒体活性.李博玲等[13]发现0.25 mg/mL褪黑素可以显著提高精子的活率、活力、线粒体活性和顶体完整性.本研究证实，合理浓度的褪黑素可显著提高湖羊精液冷冻解冻后的精子活力.本研究中褪黑素的最适合浓度为20 mg/mL，这与宋博宇[17]的研究结果一致，但与绒山羊[3]、猪[4，13]、牛[1，18]中的最适合浓度不一致，这可能与品种和精液自身褪黑素基础量不同有关.

3.2 褪黑素对精子顶体完整性的影响

在精子的保存过程中，精子顶体形态的完整性对精子能否成功授精起关键作用.研究表明，精子冷冻解冻后顶体完整性会显著下降.解冻后精子质膜的完整性对维持精子自身顶体反应、获能和新陈代谢等起着至关重要的作用，但质膜在精子冷冻解冻过程中却容易受到氧化损伤，精子质膜脂质过氧化会导致膜通透性增加，进而影响精子抗冻能力[19].有关研究表明，稀释液中添加褪黑素可以保护精子质膜对抗环境的影响.López等[20]研究证实褪黑素能减少精子中碱性磷酸酶的流失，防止精子质膜脂质过氧化.Mayo等[21]发现在冷冻稀释液中添加褪黑素会引起内源性抗氧化酶活性的上调，减少冷冻解冻过程中产生的ROS，可有效保护顶体形态的完整性.张建瑞等[22]的研究证明，褪黑素可抑制ROS的活性以及NO的过度产生，对质膜和顶体具有保护功能.Martm-Hidalgo等[23]的研究证实，褪黑素可保护线粒体并抑制质膜的过氧化反应.本研究也证实，添加20 mg/mL褪黑素可极显著提高湖羊精子解冻后的顶体完整率，这与在绒山羊[3]、猪[4，12-13]、牛[1，18]身上取得的试验结果基本一致.

3.3 褪黑素对精浆中GSH和MDA含量的影响

精浆、精子内具有一定的抗精子脂质过氧化物质，此种物质又被称为精液抗氧化系统.精子抗氧化系统中的成分主要有：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、维生素E和辅酶Q10等.这些物质可以清除ROS等.相关研究表明，褪黑素不仅具有抗精子膜多聚不饱和脂肪酸过氧化损伤的保护性功能，也可激活或增强过氧化歧化酶和GSH过氧化物酶的抗氧化酶活性，间接发挥抗氧化作用[24-25].李博玲等[13]的研究证实，在猪冷冻稀释液中添加0.25 mg/mL褪黑素可以显著降低冷冻后精子的ROS含量，显著提升GSH的抗氧化效能.霍敏等[3]的研究证实，在绒山羊冷冻稀释液中添加褪黑素可降低ROS水平，减少冷冻保存后精子受到的氧化损伤.本研究证实，在湖羊精液冷冻稀释液中添加20 mg/mL褪黑素，精浆中的GSH含量显著增加，说明GSH过氧化物酶活性显著增强，系统的整体抗氧化性显著提高.

由于ROS攻击精细胞质膜引发脂质过氧化反应，从而产生MDA等脂质过氧化物，而ROS等会对精子造成过度的氧化损伤，导致精子的运动能力和受精能力下降.任俊玲等[26]的研究发现，脂质过氧化反应程度可根据MDA的浓度判断，浓度越高，精子中氧自由基代谢程度越强烈，表明精子质量越差.本研究发现，添加20 mg/mL褪黑素，试验2组在冻精解冻后精浆中的MDA含量极显著降低，间接地证实了精浆中的ROS水平降低，且对精子的抗氧化损伤减轻.