一种小片段缺失型β地中海贫血的血液学特征分析和产前诊断

王继成 姚翠泽 秦丹卿 黄华洁 袁腾龙 杜丽

(广东省妇幼保健院 医学遗传中心、广东省妇幼代谢与遗传病重点实验室，广东 广州511442)

地中海贫血(简称地贫)是一组常见于我国南方地区的遗传性血液病，主要分为α地贫和β地贫两类。β地贫是由于β珠蛋白基因(HBB)突变导致β珠蛋白肽链合成缺如或减少，致使α/β珠蛋白肽链比例失衡而引起的溶血性贫血。与缺失型多见的α地贫不同，β地贫主要是由HBB基因点突变所致。迄今为止，全球已发现200余种HBB基因致病突变，其中CD41-42(-TCTT)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、CD17(A>T)、CD26(GAG>AAG)、-28(A>T)和CD71-72(+A)等6种突变，共占我国南方地区全部突变类型的90%以上[1,2]。目前临床上通常运用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)结合反向点杂交(reverse dot blot，RDB)的方法或液相芯片技术，检测中国人最常见的17种β珠蛋白基因突变[3]，而对于其他类型的突变，需要使用其他检测技术才能发现。我们对通过基因测序发现的7例HBB: c.268_281delAGTGAGCTGCACTG (CD89_93-14bp)杂合突变的β地贫患者进行血液学特征分析，并对其中3个家系实行了产前诊断，报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2012～2019年就诊于广东省妇幼保健院，经珠蛋白基因检测确诊为β地贫(CD89_93-14bp)的7例患者。其中6名患者为广东籍，1名患者为江西籍居民。年龄为19～35岁，包括成年的4名男性和3名女性。采集所有患者外周血用作血常规和血红蛋白电泳分析，提取外周血基因组DNA用于珠蛋白基因检测。于孕16～20周，对3个家系的孕妇行羊水穿刺进行地贫的产前诊断。

1.2 研究方法

1.2.1 血液学参数分析 运用Sysmex XS.1000i全自动血细胞分析仪(日本希森美康株式会社)对外周血进行包括血红蛋白量及平均红细胞体积(mean corpuscular volume，MCV)、平均红细胞血红蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)等红细胞参数分析。使用快速电泳分析系统(法国sebia capillary2)对外周血进行血红蛋白组分分析。

1.2.2 珠蛋白基因诊断 采用QIAmp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取外周血和羊水细胞的基因组DNA。应用由中山大学达安基因股份有限公司提供试剂的液相芯片技术检测3种常见缺失型和3种点突变型α地贫及17种β地贫突变。设计引物对HBB基因分成3个片段进行扩增和Sanger基因测序。PCR引物序列见表1。PCR扩增体系为30μl：15μl的PremixLA,10 pmol/μl的引物各2μl，4μl基因组DNA。反应条件为95℃预变性5min，95℃ 30s→60℃ 45s→72℃ 45s，共35个循环，72℃延伸。1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。将PCR扩增产物送广州生工生物有限公司使用美国ABI3100 DNA测序仪进行双向测序。

表1 HBB基因测序引物序列

2 结果

2.1 分子诊断和产前诊断结果 常规地贫基因检测未发现7例患者有突变，基因测序结果表明7例患者均为β珠蛋白基因小片段缺失(HBB: c.268_281delAGTGAGCTGCACTG)杂合突变，突变的测序结果见图1。7例患者中，有3例患者的配偶经常规地贫基因检测显示为常见的β0或β+地贫，β地贫产前分子诊断结果显示2个胎儿遗传了父母一方的此种小片段缺失突变，1个胎儿β地贫未见异常突变。结果见表2。

图1 HBB: c.268_281delAGTGAGCTGCACTG测序图

2.2 血液学参数结果 7名患者的血液学参数与常见的β0地贫相似， Hb、 MCV和MCH有明显的降低，均表现为小细胞低色素性轻度贫血。血红蛋白电泳组分分析可见轻度升高的Hb F和Hb A2，这些都显示HBB: c.268_281delAGTGAGCTGCACTG这种小片段缺失突变会导致β0地贫。所有患者详细的血液学参数结果见表3。

表2 3个家系β地贫产前诊断结果

表3 7名患者血液学参数结果

3 讨论

β地贫具有高度的遗传异质性，在不同的种族人群中也有不同的基因突变谱。在我国南方地区已报道的近50种β珠蛋白基因突变中，多数是HBB基因上的点突变。此外也有少数β地贫是由包括HBB基因在内的β珠蛋白基因簇大片段缺失导致的[4,5]。而在HBB基因上也发现几种小片段缺失突变，其中以CD41-42(-TCTT)最为常见，其次是5’UTR;+40-43(-AAAC)较为多见[6]。这2种突变都在临床上17种β地贫突变检测范围内，通常都能检测出。然而包括CD89-93在内的小片段缺失突变如果不进行基因测序，就很难发现。

Shang等[7]于2011年中首先报道了CD89-93突变，此后这种突变的病例被零星地报道[8,9]。非3个核苷酸整倍数的缺失或插入会引起移码突变，其结果多数会造成终止密码子的提前或推后出现，从而导致编码的肽链的缩短或延长。CD89-93间的14个核苷酸(AGTGAGCTGCACTG)的缺失就会在CD89上提前出现终止密码子TGA,结果就是生成比正常β珠蛋白链明显缩短的截短蛋白。这样的蛋白或者不稳定容易降解，或对正常的β珠蛋白发生竞争性抑制，从而引起β0地贫[10]。临床上通常对血液学参数异常(MCV<80 fL、MCH<27 pg)和血红蛋白电泳HbA2>3.5%的病例就考虑是β地贫的可能。本研究中7名患者的MCV、MCH和HbA2的结果都符合β0地贫的表现，与曾劲伟等[11]报道的病例相似，而常规地贫基因检测并未发现异常突变，这时就需要应用其他检测技术进一步基因诊断。所以常规地贫基因检测结果需要与筛查结果结合临床表现综合分析。

由于β+/β0和β0/β0会引起中重度地贫，对于夫妻一方有检测出β+或β0地贫，更需要明确地贫筛查结果异常病例的突变类型，从而避免中重度β地贫患儿的出生。本研究中对3个明确地贫突变类型的家系进行了产前诊断，幸运的是其中2个胎儿只遗传了CD89-93一种突变，另1胎儿完全未遗传父母的突变基因。我国广东、广西和海南等南方地区是地贫的高发区域[12]，虽然罕见地贫基因型尤其是小片段缺失型β地贫在人群中所占的比例不高，但是进行此类罕见突变的检测和研究仍很有必要，因为只有精确诊断突变类型，才能给产前诊断和遗传咨询提供重要的参考意义。总之，随着对地贫基因突变谱的认识的加深，联合使用包括GAP-PCR、MLPA、CMA和基因测序在内的多种分子诊断技术，就会发现更多的大片段或小片段缺失型β地贫。