异常血红蛋白Hb Phnom Penh[α117(GH5)Phe-Ile-α118(H1)Thr (α1)]家系的分子诊断与临床特征分析

姚翠泽 张蕊 秦丹卿 王继成 梁杰 梁凯玲 杜丽*

(1.广东省妇幼保健院 医学遗传中心，广东 广州 511442；2.惠州市第二妇幼保健院产前诊断中心，广东 惠州 516000)

血红蛋白(hemoglobin，Hb)是人体内运输氧的载体，每个血红蛋白由2条(珠蛋白链和2条(珠蛋白链组成，而珠蛋白基因发生缺陷导致珠蛋白链分子结构发生异常，称为异常血红蛋白。若这种珠蛋白氨基酸异常发生在血红蛋白分子内部，对其空间构象和功能影响较大，则临床表现明显；若这种改变发生在血红蛋白分子外部，则对其影响不大，没有明显的临床表现[1]。目前血红蛋白变异体数据库(http:∥globin.bx.psu. edu/)已报道了1800余种珠蛋白变异体，其中包括1300余种异常血红蛋白。在中国南方人群中常见的α-珠蛋白链上的异常血红蛋白主要有Hb Constant Spring (Hb CS)、HbQuang Sze (Hb QS)、HbWestmead (Hb WS)、Hb Q-Thailand等变异类型，若同时复合其他α0缺失型突变时会导致Hb H病，出现贫血症状[2]。鉴于此情况，异常血红蛋白的筛查和分子诊断需要得到临床工作者的重视。本研究检测到一种少见的异常血红蛋白Hb Phnom Penh [α117(GH5)Phe-Ile-α118(H1)Thr (α1)] 并对其进行了全面的家系调查和临床表型分析，现报道如下：

1 对象与方法

1.1 对象

1.1.1 先证者男，36岁，广东省惠州市人。其妻子曾生育一男孩，于孕20+周夫妇双方在惠州第二妇幼保健院行地中海贫血(地贫)筛查，检出先证者血红蛋白电泳Hb A2值低，遂转入本院进一步行地中海贫血基因检测。

1.1.2 家系其他成员该家系成员主要包括Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)、Ⅱ2(先证者妻子)、Ⅱ3(先证者妹妹)、Ⅲ1(先证者儿子)、Ⅲ2(胎儿，孕20+周)，家系图如图1所示。

图1 异常血红蛋白Hb Phnom Penh病例家系图

1.2 研究方法

1.2.1 血液学分析 乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝采血管采集外周血2ml，采用XN5000全自动血细胞分析仪及配套试剂(日本Sysmex公司)进行红细胞参数分析。采用法国CAPILLARYS 2 FLEX PIERCING全自动毛细管电泳分析系统及配套试剂(法国Sebia公司)进行血红蛋白组分分析。

1.2.2 DNA制备和地中海贫血基因诊断 采用MagPure Tissue & Blood DNA KF Kit试剂盒(广州美基生物)提取外周血基因组DNA，应用Qiagen DNA 提取试剂盒从羊水脱落细胞中提取胎儿DNA；应用PCR-流式荧光杂交法对中国南方常见的23种地中海贫血突变进行检测，包括：3种α-地中海贫血缺失型(-α3.7/、-α4.2/、--SEA/)，3种α-地中海贫血点突变型(αQSα/、αCSα/、αWSα/)及17种β-地中海贫血点突变(CD41-42、IVS-II-654、-29、-28、CD71-72、CD17、CD43、CD26、CD27-28、CD31、-32、-30、CD14-15、IVS-I-1、IVS-I-5、Int、Cap)(试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司)

1.2.3 α-珠蛋白基因测序 用Primer Premier5.0软件针对α-珠蛋白基因设计2对引物(引物由上海生工生物合成)，分别扩增α1-和α2-珠蛋白基因(HBA1和HBA2)，PCR扩增后产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后送生工生物有限公司进行双向测序。引物序列如下：HbA1 5’-TGGAGGGTGGAGACGTCCTG-3’和5’-TCCATCCCCTCCTCCCGCCCTGCCTTTTC-3’；HbA2 5’-TGGAGGGTGGAGACGTCCTG-3’和5’-CCATTGTTGGCACATTCCGG-3’，扩增产物大小分别为1181 bp和1085 bp。PCR扩增条件：95℃预变性5 min，95℃ 30 s→66℃ 30 s→72℃ 1 min，33个循环，72℃延伸10 min。

2 结果

2.1 血液学参数分析 该家系中异常血红蛋白Hb Phnom Penh杂合子成员Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1红细胞参数[Hb、平均红细胞体积(mean corpuscular volume，MCV)、平均红细胞血红蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)]均为正常，无小细胞低色素性贫血症状，详细参数见表1，毛细管血红蛋白电泳显示无异常血红蛋白带。

表1 Hb Phnom Penh病例家系成员血细胞参数、血红蛋白电泳及基因型

2.2 基因检测结果分析 液相芯片法结果提示该家系成员除Ⅱ2为东南亚型缺失杂合子以外，其他成员结果均为阴性。α-珠蛋白基因测序检出该家系成员Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1(先证者父亲、先证者、先证者儿子)均为α1珠蛋白基因第117/118密码子中间插入三联体ATC (codon 117/118+ATC)杂合突变，结果如图2所示。经与血红蛋白数据库比对(http:∥globin.bx.psu.edu)，该突变为异常血红蛋白Hb Phnom Penh。家系成员基因型结果见表1。

图2 α1珠蛋白基因第117/118密码子杂合突变(codon 117/118+ATC)的反向测序结果

3 讨论

本研究中先证者的血液学各参数(Hb 148g/L、MCV 88.8fL、MCH 30.3pg)均在正常值范围内，血红蛋白电泳Hb A2略低于2.5%，无异常血红蛋白带检出，提示可能携带α-地中海贫血。因先证者妻子常规地中海贫血基因检测结果为--SEA/αα，为避免地中海贫血患儿的出生，先证者是否携带同型其他基因突变以及针对双方携带的基因突变类型进行产前基因诊断尤为重要。该先证者经常规的地中海贫血基因检测后未发现异常突变，遂对其进行了α-珠蛋白基因测序，测序结果显示α1珠蛋白基因第117/118密码子杂合突变 (codon 117/118+ATC)。随后，我们对其家族三代成员进行家系调查，研究发现Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅱ1(先证者)、Ⅲ1(先证者儿子)均为Hb Phnom Penh杂合子。

α-地贫广泛分布于世界许多地区，在我国长江以南各省发病率较高，其中广东、广西人群中的发病率分别高达4.11 % 和14.95 %[3]。α-地中海贫血大多数是由于α-珠蛋白基因缺失引起的α+和α0-地中海贫血较为常见，除了常见的--SEA、-α3.7、-α4.23种片段缺失类型以外，阅读框内的缺失也屡有报道[4-7]，而阅读框内插入突变较为少见。本研究的惠州家系病例先证者检测为Hb Phnom Penh [α117(GH5)Phe-Ile-α118(H1)Thr (α1)]是一种比较少见的由于阅读框内插入突变引起的异常血红蛋白，这种插入突变通过基因测序定位于α1珠蛋白基因第三个外显子上，于第117/118号密码子中间插入三联体ATC(异亮氨酸残基)。Hb Phnom Penh于1998年在一名柬埔寨儿童和他父亲的病例中首次报道[8]，随后在中国和泰国人中也相继报道了Hb Phnom Penh突变体的病例且Hb Phnom Penh杂合子血液学参数均为正常[9,10]，与本研究家系中检出的Hb Phnom Penh杂合子成员的血液学表型一致。Wajcman等[8]研究认为Hb Phnom Penh突变的形成可能是由于该插入突变位点前后碱基序列趋向于发生碱基互补配对而容易发生断裂，通过基因转换补偿机制形成TCATCA的重复，使得α-珠蛋白链上的氨基酸数量由141个增加到142个氨基酸，但经血红蛋白毛细管电泳和高相液相色谱检测均无异常血红蛋白带被检出[10]，且异丙醇沉淀和热不稳定性实验也均为阴性[9]。以上病例研究将Hb Phnom Penh杂合子定义为α+-地中海贫血类型，无贫血症状。遗憾的是我们没有对该家系Hb Phnom Penh突变进行功能性研究，无法了解该种突变对α-珠蛋白链表达的影响。既往多个研究报道[9,11-13]，Hb Phnom Penh杂合突变复合其他地中海贫血突变可引起小细胞低色素的临床表型，提示尽管Hb Phnom Penh杂合子无临床表型，但当复合其他α0-地中海贫血突变时可能加重临床表型，出现贫血症状。此外，有研究在携带该突变病例中发现应用高相液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)检测时出现糖化血红蛋白值(HbA1c)偏高的现象，揭示这种异常血红蛋白会干扰 HbA1c 的HPLC测定，为临床检测准确性带来影响[9,13]。

目前针对此类无明显临床表现的异常血红蛋白病例仅通过血常规、毛细管电泳、HPLC以及常规的地中海贫血基因检测容易导致漏诊，必须通过α-珠蛋白基因测序或其他检测手段就罕见突变类型进行明确的分子诊断，在临床检测过程中应加以重视。本研究对于Hb Phnom Penh杂合子的临床特征分析和分子诊断可以提高临床工作者对该种异常血红蛋白的认识并为异常血红蛋白病的临床诊断和遗传咨询提供参考。