UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 法分析大承气汤化学成分

陆 杰王婷婷#梁 琨安 叡王新宏陈 颖

(1.上海中医药大学中药学院,上海 201203;2.上海中医药大学附属上海市中西医结合医院,上海 200082)

大承气汤由大黄、枳实、厚朴、芒硝组成,是泻法的代表方剂[1],主治阳明腑实证、里热实证、热结旁流证,临床上广泛用于治疗急性胰腺炎[2],不仅可减少急性肺损伤,促进急性胰腺炎患者胃肠蠕动,还能抑制细胞活性因子、炎症反应[3-6]。前期有人单用大承气汤于急性胰腺炎动物模型,发现该方可通过调节内皮屏障功能来减轻急性胰腺炎合并肠道毛细管内皮的损伤[7],临床疗效显著,但其物质基础尚未明确。

中药复方药效物质基础一直是中药现代化研究的热点和难点,而中药复方化学成分是重要前提[8]。UPLC 与离子阱-静电场轨道阱质谱(LTQ-Orbitrap) 联用系统已成为分析表征中药成分的重要技术[9-10],线性离子阱与Orbitrap傅里叶扫描质谱组成的串联质谱仪将线性离子阱的多级质谱功能与Orbitrap 的高分辨能力结合起来,在短时间内可实现母离子、子离子的高分辨采集和多级质谱碎裂,从而显著提高中药复杂体系中化学成分的快速鉴定与分析能力[11-12]。本实验采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 法从大承气汤中鉴定出73 种成分,包括蒽醌、黄酮、木脂素等,对研究该方物质基础、质量控制及确保临床用药安全有效具有意义。

1 材料

1.1 仪器 液质联用系统,配置Ultimate 3000 超高液相色谱仪、LTQ Orbitrap 质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；AL104 型电子天平 (瑞士Mettler-Toledo 公司)；Milli-Q 超纯水机(美国Millipore 公司)；5424R 型高速离心机(德国Eppendorf 公司)。

1.2 试剂与药物 芦荟大黄素(批号AB0839-0020)、厚朴酚(批号AB0682-0020)、柚皮苷(批号AB1848-0020)、橙皮苷(批号AB0714-0020)、欧前胡素(批号AB0831-0020) 对照品均购于成都埃法生物科技有限公司,纯度≥98%；大黄素 (批号 B20240)、大黄素甲醚 (批号B20242)、大黄酸 (批号 B20245)、大黄酚 (批号B20238)、大黄素-1-O-葡萄糖苷(批号B27009)、大黄酸-8-O-葡萄糖苷(批号B20246)、番泻苷A (批号B20380)、番泻苷B (批号B20381)、没食子酸(批号B20851)、莲花掌苷(批号B24363)、绿原酸(批号B20782)、厚朴木脂体A (批号B31151)、和厚朴酚(批号B20498)、柚皮素(批号B21596)、芹菜素(批号B20981)、橘皮素(批号B20646)、橙皮素 (批号 B20184)、芦丁 (批号B20771)、柠檬苦素 (批号B20911)、川陈皮素 (批号B20199) 对照品均购于上海源叶生物科技有限公司,纯度≥98%。大黄(批号190315-1)、厚朴(批号190409-1)、芒硝(批号180910-1) 均购于上海万仕诚药业有限公司；枳实(批号190327) 购于上海养和堂中药饮片有限公司,经上海虹桥饮片厂陈燕军主管药师鉴定为正品,符合2020年版《中国药典》 规定。色谱纯乙腈、甲醇(美国Dikma公司)；分析纯甲醇(国药集团化学试剂有限公司)。

2 方法

2.1 大承气汤化学成分数据库的构建 通过检索TCMSP、TCMID、TCM Database@ Taiwan 数据库,从大承气汤中收集293 种成分,其中大黄92 种、枳实65 种、厚朴139 种,并准确记录其分子式、精确分子量等信息,构建相关数据库。

2.2 色谱条件 Dikma Endeavorsil C18反相色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流动相水(含0.1% 甲酸)(A) -乙腈 (B),梯度洗脱 (0～12 min,95%～60% A；12～16.5 min,60%～10% A；16.5～19 min,10% A；19～20 min,10%～90% A；20～21.5 min,90% A)；体积流量0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 μL。

2.3 质谱条件 电喷雾离子源(ESI),正负离子检测模式；毛细管喷雾电压正离子3.8 kV,负离子3.2 kV,温度350 ℃；鞘气体积流量35 arb；辅助气体流量15 arb；一级质谱采用全扫描模式,分辨率60 000,m/z 100～1 200；二级质谱采用数据依赖型扫描模式,分辨率15 000,碰撞诱导解离。

2.4 溶液制备

2.4.1 对照品溶液 进样前,精密称取大黄素甲醚、大黄酸、大黄酚、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、没食子酸、莲花掌苷、柚皮素、柚皮苷、芹菜素、橘皮素、橙皮苷、橙皮素、欧前胡素、芦丁、柠檬苦素、川陈皮素、绿原酸、厚朴木脂体A 对照品适量,置于同一量瓶中,甲醇稀释至10 μg/mL,作为混合对照品溶液1；另精密称取芦荟大黄素、大黄素、番泻苷A、番泻苷B、厚朴酚、厚朴酚对照品适量,置于不同量瓶中,甲醇稀释至10 μg/mL,作为单标对照品溶液,均用0.22 μm 微孔滤膜过滤,备用。

2.4.2 供试品溶液 称取厚朴24 g、枳实12 g、大黄12 g,前两者加入360 mL 蒸馏水浸泡30 min,加热至沸腾状态,微沸30 min 后500 目滤布过滤,滤液热浸后者10 min,前两者药渣加入240 mL 蒸馏水煎煮20 min,滤布过滤,滤液热浸后者药渣10 min,合并2 次滤液,趁热冲入芒硝6 g,搅拌溶解后冷冻干燥,制成生药量5%的大承气汤浸膏粉,4 ℃下保存备用。精密称取1 g,加适量水超声溶解,精密移取1 mL 置于50 mL 量瓶中,甲醇定容,经0.22 μm 微孔滤膜过滤,即得,取10 μL 进样。

3 结果

3.1 色谱峰鉴定 构建大承气汤全方数据库后,对于有对照品指认的化合物,采取比对出峰时间、准分子离子峰、二级质谱碎片来鉴定确认；对于没有对照品指认的化合物,根据其精确分子量信息通过Xcalibur 2.1 工作站得到最可能的分子式(误差小于1.0×10-5),之后在数据库中进行检索,如有相配匹配的化合物分子式,则采用Mass frontier 7.0 软件进行裂解规律预测,对比二级质谱碎片信息进行确认,通过Mass Frontier 7.0 软件分析二级碎片峰裂解规律,将化合物mol 结构导入软件中进行模拟碎裂,找出相关信息,分析可能的裂解途径,从而验证其结构准确性。

结果,从大承气汤中快速鉴定出73 个化合物,包括16个黄酮、23 个蒽醌、13 个木脂素、6 个酚类、2 个生物碱、5 个香豆素、8 个其他类,UPLC-LTQ-Orbitrap-MSn总离子流图见图1,保留时间、分子式、化合物名称等数据见表1。

图1 大承气汤UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 总离子流图

3.2 主要化合物分析鉴定

3.2.1 蒽醌 采用Xcalibur 软件拟合出大黄素m/z 269.044 44 [M-H]-,与图1 中49 号峰准分子离子峰m/z 269.044 83 的相对误差为1.413×10-6,同时其二级质谱中产生碎片离子m/z 225.06 [M-H-CO2]-、241.05 [M-HCO]-,与大黄素对照品保留时间、裂解规律相同,也与文献[13]报道一致,故推测为大黄素,其二级质谱图和裂解规律见图2。

表1 大承气汤化学成分鉴定结果

续表1

图2 大黄素二级质谱图及其裂解途径

采用Xcalibur 软件拟合出大黄酸m/z 283.023 71 [MH]-,与图1 中60 号峰准分子离子峰m/z 283.024 29 的相对误差为2.034×10-6,同时其二级质谱中产生碎片离子m/z 239.03 [M-H-CO2]-,与大黄酸对照品保留时间、裂解规律相同,也与文献[14]报道一致,故推测为大黄酸,其二级质谱图和裂解规律见图3。

采用Xcalibur 软件拟合出番泻苷A m/z 861.187 27 [MH]-,与图1 中28 号峰准分子离子峰m/z 861.186 16 的相对误差为-1.11×10-6,同时其二级质谱中产生碎片离子m/z 699.13、537.08,分别为母离子丢失1、2 个葡萄糖苷所得,与番泻苷A 对照品的保留时间、裂解规律相同,也与文献[15]报道一致,故推测为番泻苷A,其二级质谱图和裂解规律见图4。

图3 大黄酸二级质谱图及其裂解途径

3.2.2 黄酮 图1 中19 号峰的一级质谱在负离子模式下的准分子离子峰为m/z 579.170 84,其保留时间与柚皮苷对照品一致,而且其二级质谱中m/z 271.06 [M-H-Rha-Glc]-与柚皮苷对照品裂解信息相同,也与文献[16]报道一致,故确定为柚皮苷。图1 中22 号峰在负离子模式下的准分子离子峰为m/z 609.144 84 [M-H]-,采用Xcalibur 软件拟合出芦丁m/z 609.145 01 [M-H]-,相对误差为-0.171×10-6,同时其二级质谱中存在m/z 301.04 [MH-Rha-Glc]-等碎片离子,与芦丁对照品的保留时间、裂解规律相同,也与文献[17]报道一致,故推测为芦丁,其二级质谱图和裂解规律见图5。

图4 番泻苷A 二级质谱图及其裂解途径

图5 芦丁二级质谱图及其裂解途径

3.2.3 木脂素 图1 中68 号峰的保留时间为14.24 min,在负离子模式下其一级质谱准分子离子峰为m/z 265.122 16 [M-H]-,同时其二级质谱中存在m/z 247.11 [M-H-H2O]-碎片离子,与厚朴酚对照品保留时间、裂解规律相同,也与文献[18]报道一致,故推测为厚朴酚,其二级质谱图和裂解规律见图6。

3.2.4 其他类 图1 中33 号峰在正离子模式下的一级质谱准分子离子峰为m/z 471.202 61 [M+H]+,采用Xcalibur拟合出其柠檬苦素m/z 471.201 34 [M+H]-,相对误差为2.686×10-6,同时其二级质谱中产生碎片离子m/z 425.20[M+H-CH2O2]+、367.19 [M+H-2CH3-H2O]+、339.20[M+H-CH2O2-2CH3-H2O-CO]+,与柠檬苦素对照品保留时间、裂解规律相同,也与文献[16]报道一致,故推测为柠檬苦素,其二级质谱图和裂解规律见图7。

图6 厚朴酚二级质谱图及其裂解途径

图7 柠檬苦苷二级质谱图及其裂解途径

4 讨论

中药复方作用的特点是多成分、多靶点相互作用,故单一成分并不能体现其实际疗效。中药质量控制应聚焦全方中最大限度代表药效的化学成分,构建以药效成分为指导的相关体系。

UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 具有高分离度、高灵敏度、高精密度的特点,在样品分析过程中可实现一级质谱MS 和多级质谱MSn同步采集,得到一级质谱分子离子峰、二级碎片离子,从而实现对复方中化学成分的快速分析鉴定的目的。本实验采用该方法从大承气汤中快速鉴定出73 个化合物,主要为黄酮、蒽醌、木脂素等,其中蒽醌类化合物在选择性离子碰撞诱导解离中的主要裂解方式是失去母核基团中CO,并保留共轭体系,其侧链取代基 (主要为OH、CH3、OCH3、COOH) 容易以H2O、CH3、CH2、CO2等中性小分子片段的形式丢失；黄酮类化合物中黄酮苷的结构特点主要是与葡萄糖或鼠李糖等形成氧苷,在质谱高能碰撞下苷键连续断裂,丢失糖基,生成高强度的黄酮苷元碎片；木脂素类化合物中厚朴酚特征离子峰m/z 247 形成了π-π 共轭体系,使其结构相对稳定,在质谱图中的丰度较高。

5 结论

UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 法可快速、准确地对大承气汤中化学成分进行定性分析,从而全面阐明其成分组成。结果,从中鉴定出73 个化合物,包括16 个黄酮、23 个蒽醌、13 个木脂素、6 个酚类、2 个生物碱、5 个香豆素及其他成分,可为该方临床应用及质量控制提供参考。