一测多评法同时测定表虚感冒颗粒中9 种成分

何 敏,陈潇潇,陈 燕*,李佳佳

(1.东南大学附属中大医院药学部,江苏 南京 210009;2.中国药科大学药学院,江苏 南京 210009)

表虚感冒颗粒由桂枝、白芍、葛根、炒苦杏仁、生姜、大枣6 味药材组成,可用于发热恶风、有汗、头痛项强、咳嗽痰白、鼻鸣干呕、苔薄白、脉浮缓等感冒风寒表虚证的治疗[1],该制剂收载于2015 年版《中国药典》 一部[1],但仅以臣药白芍所含芍药苷为检测指标,而文献[2-4]也仅对其单一成分进行定量分析。中药及其制剂有效成分繁多复杂,药理作用相辅相承,单一成分难以有效控制其质量稳定性和疗效一致性,故多指标成分测定已成为相关质量评价的发展趋势。

按照中药质量标志物确认原则[5],本实验选取质量稳定、价廉易得的葛根素作为内标,采用一测多评法同时测定表虚感冒颗粒中君药桂枝主要药效成分肉桂酸、桂皮醛,臣药白芍主要活性成分氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷,佐药葛根特征性成分3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷的含有量,以期建立该制剂多指标成分质量控制模式,并为提高相关质量标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695 型高效液相色谱仪(美国沃特斯公司)；Agilent 1200 型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；FA2004 型电子天平(德国赛多利斯公司)；SB25-12DT 型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试剂与药物 染料木苷 (批号111709-201702,纯度99.9%)、肉桂酸 (批号110786-201604,纯度98.8%)、桂皮醛 (批号110710-201821,纯度99.6%)、芍药苷 (批号110736-201943,纯度95.1%)、葛根素 (批号110752-201816,纯度95.4%) 对照品均购于中国食品药品检定研究院；氧化芍药苷(批号18031641,纯度98.8%)、芍药内酯苷(批号18040323,纯度98.5%)、3′-羟基葛根素 (批号17051825,纯度100.0%)、3′-甲氧基葛根素(批号17032021,纯度99.7%) 对照品均购于上海同田生物技术股份有限公司。表虚感冒颗粒 (每袋装10 g,批号20190142、20190602、20200102) 来源于辽宁华润本溪三药有限公司。乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相乙腈(A) -0.1%甲酸(B),梯度洗脱(0～9.0 min,15.0%A；9.0～20.0 min,15.0%～23.0% A；20.0～35.0 min,23.0%～34.0% A；35.0～45.0 min,34.0%～40.0% A；45.0～50.0 min,40.0%～15.0%A)；体积流量0.9 mL/min；柱温25 ℃；检测波长230 nm (0～20.0 min,氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷)[6-7]、250 nm (20.0～35.0 min,3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷)[8-10]、280 nm (35.0～50.0 min,肉桂酸、桂皮醛)[11]；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷、肉桂酸、桂皮醛对照品适量,50% 乙醇制成质量浓度分别为0.408、1.712、2.998、1.214、3.856、0.992、0.218、0.172、1.954 mg/mL 的贮备液,分别精密吸取1.0 mL,50%乙醇定容至20 mL,即得(各成分质量浓度分别为20.4、85.6、149.9、60.7、192.8、49.6、10.9、8.6、97.7 μg/mL)。

2.3 供试品溶液制备 取颗粒适量,研细,取粉末约2.0 g,精密称定,精密加入50%乙醇25 mL,称定质量,超声处理30 min,放冷,50%乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,即得。

2.4 阴性样品溶液制备 按照颗粒制备工艺和处方比例,分别制备缺白芍、缺葛根、缺桂枝的阴性样品,按“2.3” 项下方法制备,即得。

2.5 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,结果见图1。由此可知,各成分色谱峰峰形对称,分离度均大于1.5,理论塔板数按各成分计均不小于4 500,阴性无干扰,表明该方法专属性良好。

2.6 线性关系考察 精密吸取“2.2” 项下贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL,50% 乙醇定容至20 mL,制成对照品溶液Ⅰ～Ⅵ,在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.7 精密度试验 取“2.2” 项下对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次,测得氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷、肉桂酸、桂皮醛峰面积RSD 分别为1.05%、0.91%、0.61%、0.96%、0.57%、1.01%、1.10%、1.23%、0.68%,表明仪器精密度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液,分别于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷、肉桂酸、桂皮醛峰面积RSD 分别为1.01%、0.92%、0.58%、0.99%、0.63%、0.98%、1.07%、1.25%、0.71%,表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.9 重复性试验 取同一批颗粒,按“2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,测得氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷、肉桂酸、桂皮醛含有量RSD分别为1.34%、1.27%、0.95%、1.25%、0.84%、1.52%、1.78%、1.86%、0.99%,表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 取各成分含有量已知的同一批颗粒9 份,研细,每份取约1.0 g,精密称定,按照2020 年版《中国药典》 四部要求精密加入对照品溶液 (各成分质量浓度分别为氧化芍药苷0.212 mg/mL、芍药内酯苷0.976 mg/mL、芍药苷2.154 mg/mL、3′-羟基葛根素0.816 mg/mL、葛根素2.852 mg/mL、3′-甲氧基葛根素0.718 mg/mL、染料木苷0.126 mg/mL、肉桂酸0.094 mg/mL、桂皮醛1.142 mg/mL) 0.5、1.0、1.5 mL 各3 份,按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷、肉桂酸、桂皮醛平均加样回收率(RSD) 分别为98.39%(1.20%)、100.01% (0.81%)、99.56% (0.78%)、99.73% (1.02%)、100.08% (0.75%)、97.99%(1.39%)、97.62% (1.54%)、96.98% (1.13%)、98.97% (0.95%)。

2.11 相对校正因子测定 精密吸取“2.6” 项下对照品溶液Ⅰ～Ⅵ,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,以葛根素为内标,计算其他8 种成分的相对校正因子fk/s,公式为fk/s= fk/fs=(CkAs)/(CsAk),其中Ck为其他成分含有量,Ak为其他成分峰面积,Cs为内标含有量,As为内标峰面积,结果见表2。

2.12 耐用性试验

2.12.1 仪器、色谱柱 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,考察Waters 2695、Agilent 1200 型色谱仪及Agilent ZORBAX SB-C18、Topsil C18、Thermo Hypersil Gold C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 对相对校正因子的影响,结果见表3,可知均无明显影响(RSD＜5%)。

2.12.2 柱温 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,考察柱温23、24、25、26、27 ℃对相对校正因子的影响,结果见表4,可知均无明显影响(RSD＜5%)。

2.12.3 体积流量 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,考察体积流量0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min 对相对校正因子的影响,结果见表5,可知均无明显影响(RSD＜5%)。

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

表4 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.13 色谱峰定位 精密吸取“2.2” 项下对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,考察“2.12.1” 项下仪器、色谱柱对相对保留时间的影响,结果见表6,可知均无明显影响(RSD＜5%)。

表5 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

表6 不同仪器、色谱柱对相对保留时间的影响Tab.6 Effects of different instruments and columns on relative retention time

2.14 样品含有量测定 取3 批颗粒,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,每批3 份,在“2.1”项色谱条件下进样测定,分别采用外标法和一测多评法计算含有量,结果见表7,可知2 种方法所得结果无明显差异[相对平均偏差(RAD) ＜5.0%]。

表7 各成分含有量测定结果（mg/g）Tab.7 Results of content determination of various components （mg/g）

3 讨论

3.1 指标成分选择 表虚感冒颗粒中桂枝发汗解肌,助阳化气[12],为君药；白芍养血调经,敛阴止汗,为臣药；葛根解肌退热,炒苦杏仁降气止咳平喘,合为佐药；大枣益气和中,生姜发汗解表,引药入肺,合为使药,诸药合用,共奏散风解肌、和营退热之功效。肉桂酸、桂皮醛等挥发油为桂枝主要药效成分,芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷等单萜为白芍主要活性成分,3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷等异黄酮为葛根主要特征成分。因此,本实验按照中药质量标志物确认原则,选取上述化合物作为指标成分,可更全面地评价表虚感冒颗粒整体质量。

3.2 供试品溶液制备方法选择 本实验首先考察了提取溶剂 (甲醇[13]、30% 乙醇[8]、50% 乙醇[6-7]、70%乙醇[9,14]),发现50%乙醇提取时各成分综合提取率最佳。再考察了提取方式 (超声[6-7,14]、加热回流[8-9])、提取时间 (15、30、60 min),发现超声提取30 min 时各成分均能提取完全,可能与表虚感冒颗粒中6 味药材均经水煎煮后入药有关。

3.3 含有量分析 表7 显示,不同批次样品之间各成分含有量存在一定差异,以氧化芍药苷、染料木苷、肉桂酸更明显,可能与原药材、产地、采收季节差异及生产过程中控制参数等有关。因此,建议药品生产企业和监管部门进一步完善表虚感冒颗粒质量控制标准,对原药材来源和制剂生产过程加以控制,以确保该制剂质量稳定性和疗效一致性。

4 结论

本实验采用一测多评法同时测定表虚感冒颗粒中氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、染料木苷、肉桂酸和桂皮醛的含有量,该方法简便准确,可为全面评价该制剂质量提供有力依据。