薄荷-荆芥穗挥发油羟丙基-β-环糊精包合物的制备

王 琪胡佳亮张金良郭 宁吴 飞 林 晓*康兴东*冯 怡

(1.上海中医药大学中药学院,上海 201203;2.上海中医药大学中药现代制剂技术教育部工程研究中心,上海 201203;3.江西普正制药股份有限公司,江西 吉安 343100)

薄荷为唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部分,具有疏散风热、清利头目等作用；荆芥穗为唇形科植物荆芥 Schizonepeta tenuisfolia Briq.的干燥花穗,具有解表散风、透疹等作用,在辛凉解表制剂中常将两者混合后提取挥发油,是发挥相关疗效的重要物质基础[1]。其中,薄荷挥发油主要成分为薄荷脑、L-薄荷酮,而荆芥穗挥发油主要由胡薄荷酮、L-薄荷酮等成分组成。

大多数挥发油具有不稳定、易挥发、刺激性强等特点,为了提高该成分在液体制剂中的稳定性,常采用β-环糊精、羟丙基-β-环糊精对其进行处理[2-3]。本实验制备了薄荷-荆芥穗挥发油羟丙基-β-环糊精包合物,并优化了其包合工艺[4],以期为该制剂研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器 XP205 型电子分析天平(0.01 mg,瑞士Mettler-Toledo 公司)；FA2104N 型电子分析天平(0.1 mg,上海精密科学仪器有限公司)；Labconco 12 Plus Free Zone 型冷冻干燥机(美国Labconco 公司)；SHJ-6AB 型磁力搅拌水浴锅(常州金坛良友仪器有限公司)；DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；TGL-18C 型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；Aglient 7890A型气相色谱仪(美国安捷伦科技公司)；UPR-I-10T 型纯化水制备仪(成都超纯科技有限公司)；玻璃仪器(上海青阳生物科技有限公司)。

1.2 试剂与药物 薄荷脑(批号110728-201707,纯度99.8%)、L-薄荷酮(批号111705-201105,纯度99.8%)、胡薄荷酮(批号111706-201606,纯度99.8%) 对照品(中国食品药品检定研究院)；羟丙基-β-环糊精(批号180101,淄博千汇生物科技有限公司)。薄荷-荆芥穗挥发油(批号190304,薄荷脑、L-薄荷酮、胡薄荷酮质量分数分别为38%、18%、17%,江西普正制药股份有限公司)。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 包合物制备 参考文献[5-7]报道。精密称取一定量羟丙基-β-环糊精,加适量水,在60 ℃下溶解后冷却至所需温度,吸取少量挥发油,无水乙醇稀释后缓慢滴到羟丙基-β-环糊精溶液中,恒温下磁力搅拌一定时间,冷冻干燥,少量乙酸乙酯洗涤,40 ℃下烘干,即得。

2.2 挥发油含有量测定

2.2.1 色谱条件 参考文献[8]报道。HP-5 型高效毛细管色谱柱(0.32 mm×30 m,0.25 μm)；载气N2,体积流量1 mL/min；进样口温度250 ℃；程序升温,60 ℃下保持1 min,3 ℃/min 升至126 ℃,26 ℃/min 升至230 ℃,保持2 min；FID检测器温度280 ℃；进样量0.20 μL,不分流进样。色谱图见图1。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取薄荷脑、L-薄荷酮、胡薄荷酮对照品适量,置于量瓶中,甲醇溶解稀释,即得(0.10 mg/mL,3 种成分质量浓度分别为0.100 2、0.102 3、0.098 6 mg/mL)。

图1 各成分GC 色谱图Fig.1 GC chromatograms of various constituents

2.2.3 供试品溶液制备 精密称取干燥包合物200 mg,置于锥形瓶中,加入50 mL 乙醇,称定质量,超声处理20 min,放冷,乙醇补足减失的质量,摇匀,12 000 r/min 离心10 min,取上清液,即得。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 线性关系考察 分别取对照品薄荷脑50.20 mg、L-薄荷酮51.25 mg、胡薄荷酮49.40 mg,置于5 mL 量瓶中,甲醇定容至刻度,分别制成10.00 mg/mL 溶液,甲醇依次稀释至5.00、2.50、1.00、0.10、0.05、0.01 mg/mL,各精密吸取0.2 μL,在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归,得薄荷脑、L-薄荷酮、胡薄荷酮方程分别为Y=9 398.4X-86.048 (r=0.999 6)、Y=9 138.9X-93.553 (r=0.999 6)、Y=8 038.8X-73.495(r=0.999 6),分别在0.01～10.04、0.01～10.25、0.01～9.88 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.2.4.2 精密度试验 精密吸取“2.2.2” 项下对照品溶液适量,在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定6 次,每次0.2 μL,测得薄荷脑、L-薄荷酮、胡薄荷酮峰面积RSD 分别为1.75%、1.86%、1.79%,表明仪器精密度良好。

2.2.4.3 稳定性试验 精密吸取“2.2.3” 项下同一份供试品溶液适量,于0、2、4、6、8、12 h在“2.2.1” 项色谱条件下各进样0.2 μL 测定,测得薄荷脑、L-薄荷酮、胡薄荷酮峰面积RSD 分别为1.76%,1.81%、1.82%,表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.2.4.4 重复性试验 取6 份包合物,每份约200 mg,按“2.2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.2.1” 项色谱条件下各进样0.2 μL 测定,测得薄荷脑、L-薄荷酮、胡薄荷酮峰面积RSD 分别为1.68%、1.28%、1.48%,表明该方法重复性良好。

2.3 包合率、含油率、收率测定 指标性成分薄荷脑-L-薄荷酮-胡薄合酮(1∶1∶1) 包合译价的计算公式分别为包合率=包合物实际含油量/挥发油加入量×100%、含油率=包合物实际含油量/包合物质量×100%、收率=[包合物质量/ (羟丙基-β-环糊精加入量+挥发油加入量) ]×100%[9]。

2.4 综合评分计算 以包合率 (Y1)、含油率(Y2)、收率(Y3) 的综合评分为评价指标[10],采用G1主观赋权法对原始数据进行处理[11-12],上述3 种指标分别赋予权重系数0.5、0.3、0.2[13],计算综合评分(Y),公式为Y=(Y1/Y1max) ×0.5+(Y2/Y2max) ×0.3+(Y3/Y3max) ×0.2。

2.5 单因素试验 查阅文献[14-16],本实验选择羟丙基-β-环糊精与挥发油比例、羟丙基-β-环糊精质量分数、包合温度、包合时间、搅拌速度作为影响因素,因素水平见表1,结果见图2～6。由此可知,羟丙基-β-环糊精与挥发油比例对包合效果有显著影响(P＜0.05),最优工艺暂定为羟丙基-β-环糊精与挥发油比例12∶1,羟丙基-β-环糊精质量分数40%,包合温度40 ℃,包合时间1.5 h,搅拌速度600 r/min。

表1 单因素试验因素水平Tab.1 Factors and levels for single factor tests

2.6 Box-Behnken 响应面法 在单因素试验基础上,选择羟丙基-β-环糊精与挥发油比例(A)、羟丙基-β-环糊精质量分数(B)、包合温度(C) 作为影响因素,含油率、包合率、收率的综合评分(Y) 作为评价指标,Box-Behnken 响应面法优化包合工艺[17]。因素水平见表2,结果见表3。

图2 羟丙基-β-环糊精与挥发油比例对综合评分的影响Fig.2 Effect of （hydroxypropyl-β-cyclodextrin） -volatile oils ratio on comprehensive score

图3 羟丙基-β-环糊精质量分数对综合评分的影响Fig.3 Effect of hydroxypropyl-β-cyclodextrin mass fraction on comprehensive score

图4 包合温度对综合评分的影响Fig.4 Effect of inclusion temperature on comprehensive score

图5 包合时间对综合评分的影响Fig.5 Effect of inclusion time on comprehensive score

通过Design-Expert 8.0.6 软件对表3 数据进行二项式拟合,得到方程为Y=81.24+10.99A-19.43A2(r=0.835 6),方差分析见表4。由此可知,模型P＜0.05,失拟项P＞0.05,表明模型拟合度良好；各因素影响程度依次为A＞B＞C,其中A有显著影响(P＜0.05),而B、C 无显著影响(P＞0.05)。

图6 搅拌速度对综合评分的影响Fig.6 Effect of stirring speed on comprehensive score

表2 Box-Behnken 响应面法因素水平Tab.2 Factors and levels for Box-Behnken response surface method

表3 试验设计与结果Tab.3 Design and results of tests

通过Design Expert 8.0.6 软件进行响应面分析,结果见图7～10。由此可知,在试验参数范围内随着羟丙基-β-环糊精与挥发油比例增加,含油率逐渐降低,包合率逐渐升高,收率有升高趋势但不如包合率明显,最终达到相对稳定的水平。最终确定,最优工艺为羟丙基-β-环糊精与挥发油比例11∶1,羟丙基-β-环糊精质量分数43%,包合温度47 ℃,包合时间1.5 h,搅拌速度600 r/min,综合评分为83.24,同时为便于工业化生产,将羟丙基-β-环糊精质量分数修正为40%。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

再按照优化工艺进行3 批验证试验,结果见表5,可知综合评分平均值82.33 与预测值83.24 接近,表明该工艺稳定可行。

表5 验证试验结果（n=3）Tab.5 Results of verification tests （n=3）

3 讨论

图7 各因素对含油率的影响Fig.7 Effects of various factors on oil content

图8 各因素对包合率的影响Fig.8 Effects of various factors on encapsulation efficiency

图9 各因素对收率的影响Fig.9 Effects of various factors on yield

图10 各因素对综合评分的影响Fig.10 Effects of various factors on comprehensive score

Box-Behnken 响应面法的优势在于通过建立多项式回归模型对数据进行分析,能探究2 个因素之间交互关系对结果的影响,进一步补足单因素试验缺陷,从而更为准确地预测最优方案[18],并且该方法突破了均匀设计、正交设计受线性模型限制的缺陷,具有试验次数少、预测准确性高等优点[19]。因此,本实验采用该方法优化薄荷-荆芥穗挥发油羟丙基-β-环糊精包合物制备工艺,得到最优条件为羟丙基-β-环糊精与挥发油比例11∶1,羟丙基-β-环糊精质量分数40%,包合温度47 ℃,包合时间1.5 h,搅拌速度600 r/min,验证试验显示该工艺稳定可行。

采用环糊精包合技术对挥发油进行包合后,能有效提高后者在液体制剂中的稳定性、溶解度,而且操作简便可行,安全性高,但该方法受客体分子结构的影响较大,易造成包合前后挥发油成分发生变化[20-21]。因此,本实验又同时测定了薄荷-荆芥穗挥发油中薄荷脑、L-薄荷酮、胡薄荷酮3 个指标成分的含有量,并以挥发油包合率、包合物含油率、收率的综合评分为评价指标,以期筛选最佳包合工艺[22]。

另外,环糊精包合挥发油后自组装效应会进一步加强,可能导致中药液体制剂出现沉淀、澄明度变化等问题[23],从而影响其质量。因此,在包合过程中应适当降低环糊精的用量。