椒香温中止痛方挥发油β-环糊精包合工艺优化及其包合物表征

李双双李 希 邓 谦施崇精冯建安黄 嫣王 玉

(1.成都中医药大学药学院,四川 成都 611137;2.四川省中医药科学院中医研究所,四川 成都 610031)

椒香温中止痛方是由花椒、延胡索、香附等药材组成的中药复方,具有温中散寒、行气止痛的功效,临床上主要用于治疗脾胃虚寒引起的脘腹冷痛。方中花椒性温味辛,具有温中止痛、杀虫止痒作用,以及抗肿瘤、抗氧化、抗炎、镇痛、抗菌等药理活性[1-5],挥发油是其主要药效成分,可杀虫、抑菌、抗炎、镇痛、抗氧化、促进皮肤渗透等[6-8],能有效抑制冰醋酸引起的疼痛反应[9-10]；香附功效疏肝解郁、理气宽中、调经止痛,其挥发油具有抗炎、镇痛、抗抑郁等作用[11-12],这2 种挥发油均为全方镇痛的主要药效成分,但它们对空气和温度敏感,易氧化,在放置、贮存过程中易挥发损失。因此,本实验将优化椒香温中止痛方挥发油β-环糊精包合工艺[13-14],再对包合物进行表征,以期增加该成分的稳定性。

1 材料

KQ-300DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电热恒温水浴锅、DZTW 型调温电热套(北京市永光明医疗仪器有限公司)；JB-3型定时恒温磁力搅拌器(上海雷磁新泾仪器有限公司)；GZX-9070MBE 型电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；BT-125D 型电子天平[赛多利斯科学仪器(中国) 有限公司]；D8 Advance X 射线衍射仪、VERTEX 70V 型傅立叶变换红外光谱仪(德国布鲁克光谱仪器公司)。β-环糊精(陕西礼泉化工有限实业公司)。花椒(批号190116,产地四川)、香附(批号181117,产地广西) 均购于四川省中药饮片有限责任公司,经四川省中医药科学院中医研究所谢守德主任中药师鉴定为正品,符合2020 年版《中国药典》 要求。

2 方法与结果

2.1 挥发油提取 根据前期单因素试验结果,按照2020 年版 《中国药典》 四部挥发油测定法(甲法) 提取。称取处方量花椒、香附共300 g,置于5 000 mL 圆底烧瓶中,加10 倍量水,加热至沸腾后保持微沸状态6 h,静置30 min,收集挥发油。

2.2 包合工艺研究

2.2.1 空白回收率测定 精密吸取花椒、香附混合挥发油1 mL,置于500 mL 圆底烧瓶中,加入300 mL 蒸馏水,连接挥发油提取器,水蒸气蒸馏法提取约6 h 至油量不再增加,冷却1 h 后读取挥发油体积,平行3 次,取平均值,计算空白回收率,公式为空白回收率=挥发油体积/挥发油加入量×100%。结果,空白回收率为90%。

2.2.2 包合方法考察 目前,常用的挥发油包合方法主要有饱和水溶液法、研磨法、超声法[15-16]。本实验采用以上3 种方法制备包合物,并测定包合率、收率,公式分别为包合率=[包合物中挥发油量/ (挥发油加入量×空白回收率) ]×100%、收率=[包合物质量/ (β-环糊精加入量+挥发油加入量) ]×100%。

2.2.2.1 饱和水溶液法 称取20 g β-环糊精至500 mL 烧杯中,平行3 份,按照8%比例加入一定量水,加热使β-环糊精充分溶解。另取2 mL 混合挥发油,按1∶1 比例加入无水乙醇,混合均匀后加到冷却至40 ℃的β-环糊精饱和溶液中(边加边搅拌),在恒温磁力搅拌器下继续搅拌2 h,冷却至室温后置于4 ℃冰箱里中冷却24 h,抽滤,残渣用乙醚洗涤3 次,每次15 mL,置于40 ℃真空干燥箱中干燥4 h,称定质量,即得包合物。将包合物置于500 mL 圆底烧瓶中,加入300 mL 蒸馏水,水蒸气蒸馏法提取约6 h 至提取器中油量不再增加,冷却1 h 后读取挥发油体积,平行3 次,测定包合率、收率,结果见表1。

2.2.2.2 研磨法 称取20 g β-环糊精至500 mL烧杯中,平行3 份,按照8% 比例加入一定量水,加热使β-环糊精充分溶解,当温度降至40 ℃时加入挥发油,置于乳钵中研磨2 h,研磨液置于4 ℃冰箱中冷却24 h,抽滤,残渣用无水乙醚洗涤3次,每次15 mL,置于40 ℃真空干燥箱中干燥4 h,称定质量,即得包合物。将包合物置于500 mL 圆底烧瓶中,加入300 mL 蒸馏水,水蒸气蒸馏法提取约6 h 至提取器中油量不再增加,冷却1 h 后读取挥发油体积,平行3 次,测定包合率、收率,结果见表1。

2.2.2.3 超声法 称取20 g β-环糊精至500 mL烧杯中,平行3 份,按照8% 比例加入一定量水,加热使β-环糊精充分溶解,当温度降至40 ℃时加入挥发油,40 ℃、120 Hz 下超声处理2 h,置于4 ℃冰箱中冷却24 h,抽滤,残渣用乙醚洗涤3 次,每次15 mL,置于40 ℃真空干燥箱中干燥4 h,称定质量,即得包合物。将包合物置于500 mL圆底烧瓶中,加入300 mL 蒸馏水,水蒸气蒸馏法提取约6 h 至提取器中油量不再增加,冷却1 h 后读取挥发油体积,平行3 次,测定包合率、收率,结果见表1。

表1 3 种包合方法的比较（n=3）Tab.1 Comparison of three inclusion methods （n=3）

2.2.2.4 结果分析 饱和水溶液法所包合挥发油的平均包合率、收率均较高,其原因可能是研磨法容易破坏β-环糊精结构,研磨过程中温度逐渐降低,而超声法容易将包合后的挥发油重新萃取出来。另外,饱和水溶液法平均包合率、收率的RSD 均小于5%,表明该方法重复性良好,故本实验以其对挥发油进行包合。

2.3 Box-Behnken 响应面法

2.3.1 评价指标组合赋权

2.3.1.1 G1 法主观赋权 G1 法是专家主观认为各评价指标的重要程度赋予相应权重,是对AHP法的进一步改进,无需一致性检验。具体步骤为①确定评价指标的序关系,包合率是衡量包合效果的重要指标,故将其作为主要筛选指标；收率在大生产过程中也很有意义,在β-环糊精、挥发油投入量一定的情况下其数值越高,包合效果越好,故可作为次要筛选指标[17],上述2 项指标的重要程度依次为包合率(y1) ＞收率(y2)；②专家给出相邻指标Xk-1与Xk重要性程度之比rk的理想赋值,结合课题组其他专家意见,确定上述2 项指标的权重评价度为r2=1.6；③计算第m 个指标的权重系数Wm,公式为wm= (1 +)-1,其中wk-1=rkwk,k=m,m - 1,…,2。另外,wzj 为评价指标G1 法权重构成的向量(j=1,2,…,m),即= (w1,w2,…,wm)

2.3.1.2 熵权法客观赋权 熵权法是将各项指标原始数据进行标准化、归一化处理后,根据所得信息熵值来判断它们在综合评价中的重要性,指标信息熵越小,所提供的信息量越大,其在综合评价中所占权重就越大[18]。具体步骤为①原始数据的标准化处理,Yij= (xij- min{xij})/(max{xij} -min{xij}) ；②标准化数据的归一化处理,fij=；③求出各指标的信息熵,④ 确定各指标权重,wsj= (1 -Ei)/(m -)(j=1,2,…,m)。

2.3.1.3 组合权重计算 公式为wj=。

2.3.2 因素水平 通过前期预实验及查阅文献[19-21],选择搅拌时间 (A)、包合温度 (B)、β-环糊精与挥发油比例(C) 作为影响因素,包合率(X)、收率(Y) 作为评价指标,计算综合评分(Z),公式为Z=0.608 0Xi/Xmax+0.392 0Yi/Ymax,设计3 因素3 水平、17 个试验点,因素水平见表2,各指标组合权重见表3。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

表3 各指标组合权重Tab.3 Combined weights of various indices

2.3.3 试验设计 按照表2 因素水平加入一定量β-环糊精,并加适量蒸馏水加热搅拌制成饱和溶液,每次均加入混合挥发油与无水乙醇按1∶1 比例组成的混合液2 mL,在磁力搅拌机上保持相应温度搅拌至规定时间,冷却至室温后置于4 ℃冰箱中24 h,取出,抽滤,残渣用无水乙醚洗涤3 次,每次15 mL,置于40 ℃真空干燥箱中干燥4 h,测定包合率、收率,结果见表4。

2.3.4 方差分析 通过Design Expert 10.0 软件对表4 数据进行多元回归拟合,得到方程为Z=-112.998+24.678 75A+5.139 5B+18.369 38C-0.362AB-0.011 25AC -0.045BC -2.846 25A2-0.053 887B2-0.909 06C2,方差分析见表5。由此可知,R2=0.973 4,表明模型拟合程度良好,可用于分析预测；模型P＜0.01,失拟项P＞0.05,表明模型可靠；各因素影响程度依次为C＞B＞A。

2.3.5 响应面分析 通过Design Expert 10.0 软件进行分析,结果见图1。由此确定,最优工艺为搅拌时间1.94 h,包合温度37.34 ℃,β-环糊精与挥发油比例9.17∶1,综合评分91.12,考虑到实际操作情况,将其修正为搅拌时间2 h,包合温度37 ℃,β-环糊精与挥发油比例9∶1。

表4 试验设计与结果Tab.4 Design and results of tests

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

2.3.6 验证试验 根据“2.3.5” 项下优化工艺进行3 批验证试验,测得综合评分分别为90.42、90.11、89.74,平均90.09,与预测值91.12 相近,表明该工艺稳定可行。

2.4 包合物表征

2.4.1 显微法 取包合物、β-环糊精少许,制成水装片后置于载玻片上,显微镜在40 倍目镜下进行观察并拍照,结果见图2。由此可知,β-环糊精为规则的板状结晶,而与挥发油包合后形成不规则黑色状物,表明其物相可能发生改变。

2.4.2 TLC 法 称取包合物0.5 g,置于10 mL 量瓶中,无水乙醇定容至刻度,超声提取15 min,滤过,取上清液,作为溶液A；称取β-环糊精0.5 g,置于10 mL 量瓶中,无水乙醇定容至刻度,超声提取15 min,滤过,取上清液,作为溶液B；称取适量包合物,水蒸气蒸馏提取挥发油,精密量取0.2 mL,置于10 mL 量瓶中,无水乙醇定容至刻度,摇匀,作为溶液C；精密量取未经包合的挥发油0.2 mL,置于10 mL 量瓶中,无水乙醇定容至刻度,摇匀,作为溶液D。取上述4 种溶液各5 μL,点于同一硅胶G 薄层板上,以正己烷-乙酸乙酯(4∶1) 为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛浓硫酸溶液显色,105 ℃下烘干至斑点清晰,结果见图3。由此可知,包合物、β-环糊精中未见明显斑点,而包合物提取的挥发油斑点与未经包合的挥发油几乎一致,表明包合前后挥发油主要成分无明显变化。

2.4.3 傅里叶变换红外光谱(FTIR) 取挥发油、β-环糊精、物理混合物、包合物适量,与溴化钾混合均匀后压片,在400～4 000 cm-1波数范围内进行红外光谱扫描,结果见图4。由此可知,β-环糊精中γ-OH 发生明显的位移,由包合前的3 379.63 cm-1移至包合后的3 391.25 cm-1,而且其缔合氢键宽峰在包合后变窄,表明主客体之间形成了大量氢键,提示存在分子间包合[22]；包合后挥发油在1 724.37、1 448.44 cm-1等处的吸收峰已消失或明显减弱,而物理混合物仍然存在,表明其红外振动受到了影响,包合物制备成功。

图1 各因素响应面图Fig.1 Response surface plots for various factors

图2 样品显微图（×40）Fig.2 Microscopic images for samples （×40）

2.4.4 X 射线衍射(XRD) 取β-环糊精、物理混合物、包合物适量,设定条件为Cu 靶；电压40 kV；电流40 mA；扫描方式步进扫描,步宽0.02°；扫描范围(2θ) 3°～40°；停留时间0.1 s,结果见图5。由此可知,物理混合物衍射峰呈现混合挥发油与β-环糊精叠加的特征；包合物图谱不是挥发油与β-环糊精的简单叠加,在4°～8°处衍射峰消失,并出现新的特征峰,在15°～20°、20°～25°处出现新的衍射峰,或峰发生裂分,在25°～40°处特征峰减弱或消失,表明包合物制备成功。

3 讨论

图4 样品FTIR 图Fig.4 FTIR spectra for samples

图5 样品XRD 图Fig.5 XRD patterns for samples

前期查阅文献发现,目前大多数关于包合工艺的研究还是停留在正交设计阶段,但该方法只能进行线性数学模型拟合,确定单因素对实验结果的影响,具有精度不高、预测性不佳等缺点；响应面法可通过Design Expert 10.0 软件求得高精度的回归方程,利用其进行合理预测来得到最优工艺,并能直观反应各交互因素对实验结果的影响[23-24]。因此,本实验采用Box-Behnken 响应面法优化椒香温中止痛方挥发油β-环糊精包合工艺。

挥发油是花椒主要成分之一,具有挥发性强、稳定性差等问题,在贮存过程中易损失；α-香附酮是香附挥发油主要药效成分,功效理气止痛,与椒香温中止痛方治疗腹痛的作用相符,但该成分属于双环倍半萜类化合物,对空气、光、酸性物质等较敏感,不够稳定。为了保证椒香温中止痛方药效,并防止方中挥发油在贮存过程中发生氧化变质而造成损失,本实验采用β-环糊精对其进行包合以提高稳定性。

本实验以挥发油包合率、包合物收率为评价指标,采用主客观综合赋权的方法确定两者权重系数,既减少了赋值的不确定性,又增加了处方中各指标之间的内在联系。最终确定,最优包合工艺为β-环糊精与挥发油比例9∶1,包合温度37 ℃,搅拌时间2 h,验证试验结果表明该工艺稳定可行,而且表征试验结果显示包合物已成功形成,有利于椒香温中止痛方药效成分的控制和相关制剂工艺的改进。