基于HPLC-Q-TOF/MS法的鬼针草血清药物化学探究

王宇卿，李淑娇，庄 果

（南阳医学高等专科学校科研中心，河南南阳 473061）

鬼针草Bidens bipinnataL.又名鬼骨针、婆婆针,为菊科鬼针草属一年生草本植物,全草可作药用。鬼针草属的药材资源非常丰富,全球约有230余种,广布于亚洲、美洲的亚热带地区,在我国有9个种和2个变种,遍布全国各地,极易采集［1］。《本草拾遗》 记载鬼针草味苦,性平,无毒,具有清热解毒、祛风除湿、活血散瘀等作用,可用于痰湿瘀阻等症；《中药大词典》 中记载鬼针草味苦,性微寒,归肝、肺、胃、大肠经,具有清热解毒、散瘀消肿的功效；《中华本草》 功效分类为清热解毒药、消肿药,具有清热解毒、散瘀消肿等功效［2］。现代药理研究表明,鬼针草具有抗炎、抗氧化、抗高血压、抗高血脂和血栓形成、抑菌、免疫调节等作用［3-7］,现代临床可用于治疗腹泻、痢疾、心血管系统疾病、原发性高血压等［8-10］。目前,关于该药体内活性成分方面的研究鲜有报道,本实验首次联合采用HPLC-Q-TOF/MS技术与中药血清药物化学的相关理论和研究方法对鬼针草进行研究,旨在探求该中药发挥药效的物质基础,为鬼针草的进一步研究开发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 1260高效液相色谱系统、G6530 Q-TOF/MS质谱仪（美国安捷伦公司）；Milli Q超纯水机（美国密理博公司）；XS-105分析天平［梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司］；TGL-16G高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；WH-3微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器有限公司）；DZF-6020真空干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）。

1.2 试剂与药物 鬼针草饮片（批号 161015；产地河南南阳）购于淅川县度帮中药材种植专业合作社,经南阳医学高等专科学校王宇卿副教授鉴定为菊科鬼针草属一年生草本植物鬼针草Bidens bipinnataL.的地上部分。没食子酸（Y19M8C36143）、原儿茶酸 （Z30M6L1）、金丝桃苷（Y05J8X39277）、木樨草苷 （Y05D8H49919）、木樨草素（C24M8Q36543）,均购于上海源叶生物科技有限公司；绿原酸 （110753-200413）、芦丁 （0080-9504）、槲皮素（100081-201509）,均购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯（美国Fisher公司）；超纯水自制；其他试剂均为分析纯。

1.3 实验动物 清洁级雄性SD大鼠,体质量180～220 g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,合格证号SCXK（湘）2013-0004。

2 方法

2.1 供试品溶液制备 称取鬼针草500 g,用10倍量的水进行2次加热回流提取,每次各2 h,自然冷却后,倾出水溶液,过滤药渣,合并2次水提液进行真空减压浓缩至1.5 g生药/g浸膏,制得鬼针草样品,冷藏备用。

2.2 对照品溶液制备 分别精密称量各对照品置于10 mL量瓶中,加70%甲醇充分溶解后定容,制成适宜浓度的混合对照品溶液,经0.22 μm微孔滤膜过滤,即得。

2.3 空白血清及含药血清制备 取雄性SD大鼠12只,禁食12 h （自由饮水）,称定质量,随机分为2组,每组6只。空白组灌胃给予蒸馏水,给药组灌胃给予鬼针草（10 g生药/kg）水提液,每日早晚各1次,连续给药3 d；末次给药后60 min眼眶静脉丛取血0.5 mL,室温放置30 min后,3 000 r/min条件下离心10 min,取上清液血清0.2 mL,加入3倍量乙腈,涡旋混匀30 s,静置片刻后13 000 r/min离心10 min,取上清,于真空干燥箱浓缩至干后用100 μL 70%乙腈-水复溶,涡旋,13 000 r/min高速离心10 min,取上清液作为血清供试品。

2.4 分析条件 Poroshell 120 EC-C18色谱柱 （3 mm×150 mm,2.7 μm）；流动相乙腈（A）-0.2% 甲酸（B）,梯度洗脱（0～1 min,5%～15% A；1～7 min,15%～25% A；7～11 min,25%～40% A；11～14 min,40%～50% A；14～15 min,50%～100% A；15～20 min,100% A；20～21 min,100%～5%A）；体积流量0.5 mL/min；柱温35 ℃；进样量5 μL。

G6530A Q-TOF/MS质谱仪；AJS ESI源；ESI+、ESI模式；干燥气体温度320 ℃；干燥气体体积流量8 L/min；雾化器压力40 psi （1 psi=6.895 kPa）；鞘气温度300 ℃；鞘气体积流量12 L/min；碎裂电压175 V；毛细管电压3.5 kV；正负离子采集范围m/z100～1 700。

2.5 鬼针草及其血清中成分分析 取3批鬼针草水煎液,以及6批鬼针草血清样品在相同的色谱和质谱条件下进行HPLC-Q-TOF/MS分析,建立其指纹图谱,比较分析确定入血成分。然后参照有关文献、对照品对照及其一级、二级质谱信息初步鉴定鬼针草的入血成分。

3 结果

在鬼针草含药血清样本中共检测出11种移行成分,见图1。通过HPLC-Q-TOF/MS检测,并经过与对照品、文献相关数据对比,初步鉴定出11种移行成分,其中有机酸类5种、黄酮类5种及聚炔类1种,各化合物相关质谱信息见表1。

图1 各样品总离子流图

表1 鬼针草血中11种移行成分

3.1 有机酸类化合物结构解析 共鉴定出有机酸类化合物5个,分别为化合物1～5。化合物1,保留时间2.412 min,在负离子模式下,一级全扫描质谱分析中其准分子离子为m/z169.014 6,进一步进行二级全扫描质谱分析,其主要的碎片离子m/z151.003 0、125.023 6分别为准分子离子失去H2O和CO2后的碎片；在正离子模式下,其准分子离子为m/z171.029 1,主要碎片离子m/z127.039 5为准分子离子失去CO2后的碎片,然后与文献及对照品对照,鉴定为没食子酸［11］。化合物2,保留时间2.503 min,在负离子模式下,一级全扫描质谱分析中其准分子离子为m/z153.019 6,进一步进行二级全扫描质谱分析,其主要的碎片离子有m/z109.029 4 ［M-H-CO2］-、108.021 1 ［M-HCHO2］-；在正离子模式下,其准分子离子为 m/z155.034 1,主要碎片离子m/z111.044 6为准分子离子失去CO2后的碎片,然后与文献及对照品对照,鉴定为原儿茶酸［12］。化合物3,保留时间3.657 min,在负离子模式下,一级全扫描质谱分析中其准分子离子为 m/z353.087 4,进一步进行二级全扫描质谱分析,其主要的碎片离子有m/z179.034 4 ［M-H-C7H10O5］-、135.044 6 ［MH-C7H10O5-CO2］-；在正离子模式下,其准分子离子为m/z355.102 6,主要碎片离子m/z181.050 1为准分子离子失去C7H10O5后的碎片,然后与文献及对照品对照,鉴定为绿原酸［13］。化合物4～5在ESI+模式下均得到m/z517［M+H］+且根据精确质量数计算得分子式均为C25H24O12,峰4碎片离子m/z353.087 6 ［M-H-C9H8O4］-、191.055 8［M-H-C18H16O8］-、179.034 3 ［M-H-C16H18O9］-、355.103 1 ［M+H-C9H7O3］+,峰5碎片离子m/z353.087 5 ［M-HC9H8O4］-、191.055 4 ［M-H-C18H16O8］-、179.034 1 ［MH-C16H18O9］-、355.102 7 ［M+H-C9H7O3］+、163.039 5［M+H-C16H17O9］+,结合文献［14-17］推测峰4为3,4-二咖啡酰基奎宁酸,峰5为3,5-二咖啡酰基奎宁酸,其保留时间分别为6.156、6.223 min。

图2 黄酮类化合物特征碎裂途径

3.2 黄酮类化合物结构解析 共鉴定出黄酮类化合物5个,分别为化合物6～8、10～11,此类化合物的特征碎裂途径见图2。化合物6,保留时间为6.816 min,在负离子模式下,一级全扫描质谱分析中其准分子离子为m/z609.145 7,进一步进行二级全扫描质谱分析,其主要的碎片离子有m/z463.087 8 ［M-H-C6H10O4］-、301.034 4 ［MH-C13H22O9］-、193.013 4 ［M-H-C13H22O9-B］-、107.013 50,4A-；在正离子模式下,一级全扫描质谱分析中其准分子离子为m/z611.160 6,进一步进行二级全扫描质谱分析,其主要的碎片离子为m/z303.050 7 ［M+H-C12H20O9］+,结合文献［18-19］推测为芦丁。化合物7,保留时间7.655 min,在负离子模式下,进行一级全扫描质谱扫描,与空白血清比较,灌胃给药后的大鼠血清样品中检测到金丝桃苷原形的准分子离子峰m/z463.087 6,然后进行二级质谱扫描,其主要的碎片离子有m/z301.034 9、257.045 2、107.013 3,这些碎片为准分子离子峰分别失去C6H12O6、C6H12O6+CO2、0,4B-形成的；在正离子模式下发现其准分子离子峰m/z465.103 1及碎片离子m/z303.050 3 ［M+H-C6H12O6］+,然后通过与文献及对照品对照,鉴定为金丝桃苷［20］。化合物8,保留时间7.853 min,在负离子模式下进行一级全扫描质谱扫描,与空白血清比较,灌胃给药后的大鼠血清样品中检测到木樨草苷原形的准分子离子峰m/z447.092 5,然后进行二级质谱扫描,其主要的碎片离子有m/z285.039 7 ［M-H-C6H12O6］-、267.029 1 ［M-H-H2O］-、217.049 8 ［M-H-C3O2］-；在正离子模式下发现其准分子离子峰m/z449.108 2及碎片离子m/z287.055 4 ［M+H-C6H12O6］+,然后通过与文献及对照品对照,鉴定为木樨草苷［21］。化合物10,保留时间13.934 min,在负离子模式下进行一级全扫描质谱扫描,与空白血清比较,灌胃给药后的大鼠血清样品中检测到木樨草素原形的准分子离子峰m/z285.040 1,然后进行二级质谱扫描,其主要的碎片离子m/z267.029 1、241.050 3、217.049 8为准分子离子分别失去H2O、CO2、C3O2后形成的；在正离子模式下发现其准分子离子峰m/z287.055 3,碎片离子m/z269.045 2为准分子离子失去一分子H2O后形成的,然后通过与文献及对照品对照,鉴定为木樨草素［23］。化合物11,保留时间14.127 min,在负离子模式下进行一级全扫描质谱扫描,与空白血清比较,灌胃给药后的大鼠血清样品中检测到槲皮素原形的准分子离子峰m/z301.035 1,然后进行二级质谱扫描,其主要的碎片离子m/z257.045 4 ［M-H-CO2］-、193.013 3 ［M-H-B］-为准分子离子分别失去CO2、B环后形成的；在正离子模式下发现其准分子离子峰m/z303.050 3,碎片离子m/z275.055 3、259.060 8为准分子离子峰分别失去CO和CO2后形成的,然后通过与文献及对照品对照,鉴定为槲皮素［23］。

3.3 聚炔类化合物结构解析 化合物9,保留时间8.982 min,在负离子模式下,检测到其主要碎片有m/z423.129 6 ［M+HCOO］-、377.124 1 ［M-H］-,在正离子模式下,检测到其主要碎片有379.139 6 ［M+H］+、401.121 5［M+Na］+、217.087 1 ［M+H-C6H12O6］+、181.071 2［M+H-C13H12O3］+,然后结合文献及鬼针聚炔苷的精确分子量,初步推测为鬼针聚炔苷［22］。

4 讨论

本实验首次运用HPLC-Q-TOF/MS技术结合中药血清药物化学的相关理论和研究方法对鬼针草的体内活性成分进行研究,初步分析了鬼针草的入血成分。本实验分别采用水浴法、高氯酸法、甲醇沉淀法和乙腈沉淀法对血清样品进行处理,结果发现乙腈沉淀法得到的样品色谱图信息量较大,干扰少,最终确定采用乙腈沉淀法对血清样品进行处理。

本研究通过对比鬼针草水煎液、含药血清、空白血清以及对照品等指纹图谱,利用Qualitative Analysis等软件进行分析,根据质谱信息、保留时间、精确相对分子量及与文献和对照品对比,共鉴定出11种原型入血成分。鬼针草中入血成分主要是黄酮类、聚炔类、有机酸类等。这些成分都具有抗菌、抗炎、降血脂、降血压、清除自由基等作用［8,24-25］。这进一步证实了上述入血成分可能为鬼针草在体内发挥药效的有效组分群,以期为其后续研究开发提供验依据,也为阐明鬼针草药效物质基础提供参考。