微小RNA-190低表达调控肺癌A549细胞增殖、侵袭和凋亡的实验研究

崔杰 耿利民

肺癌是全球癌症死亡的重要原因，其发病率和死亡率一直居高不下，严重威胁着人们的身体健康[1-2]。肺癌的发生与发展是一个多因素、多阶段和多基因调控的复杂过程，其发生发展的分子机制尚不完全清楚。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由17-25个核苷酸组成的非编码RNA，可调控人类约30%基因，与肿瘤的发展发展密切相关[3]。既往研究[4-5]显示，miRNA可通过与相关靶基因3’非翻译区(3’-untranslated region，3’UTR)特异性结合影响细胞功能在肺癌中发挥着癌基因或抑癌基因的作用。越来越多的研究[6-8]显示，miR-190在结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌等多种肿瘤组织中异常表达，且可通过调控细胞增殖、侵袭和上皮间质转化等参与肿瘤的发生发展。已有学者[9-10]指出，miR-190在肺癌中表达上调，且与患者预后密切相关，但其在肺癌中的作用并不清楚。本研究旨在探讨miR-190低表达对肺癌A549细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其机制，以期为肺癌的发生发展机制及治疗提供新线索。

资料与方法

一、实验材料

人肺癌细胞株A549(中科院上海细胞库)，miR-190模拟物、miR-190抑制剂及其阴性对照(广州锐博生物公司)，DMEM培养基、胎牛血清和青链霉素(美国Hyclone公司)，胰蛋白酶(北京鼎国生物公司)，脂质体2000(美国Invitrogen公司)，辣根过氧化物酶标记的二抗(碧云天生物公司)，Trizol试剂(康为世纪生物公司)，兔抗人生长分化因子11(growth differentiation factor 11，GDF11)和β肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(美国Abcam公司)，噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)试剂和二甲基亚砜(美国Sigma公司)，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒(美国默克生物公司)，反转录试剂盒(美国Life Technologies Corp公司)，荧光素酶报告基因检测试剂盒和膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)细胞凋亡检测试剂盒(北京博迈斯科技公司)，psiCHECK-2荧光素酶载体(西安赛拓博泰生物)。Transwell小室和流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)，CO2细胞培养箱(美国Heraeus公司)，多功能酶标仪(美国BioTek公司)，倒置显微镜(美国OLYMPUS CK40公司)，荧光定量PCR仪(美国Life Technologies公司)，凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

二、细胞培养、分组及转染

使用含100 U/mL青链霉素双抗和10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5% CO2常规条件的细胞培养箱中培养A549细胞。将指数期的A549细胞以每孔3×105个接种至6孔细胞板上，置于细胞培养箱中常规培养过夜。实验分为对照(Ctrl)组、抑制剂阴性对照(anti-miR-NC)组和miR-190抑制剂(anti-miR-190)组，每组设置3个复孔。待细胞培养至70%汇合度时，参照脂质体2000说明书步骤将miR-190抑制剂/抑制剂阴性对照根据实验分组加入到A549细胞中。转染5h后更换新鲜培养基，继续培养48h后收集各组细胞并采用实时荧光定量PCR仪检测细胞中miR-190的表达水平以评价转染效果。

三、实时荧光定量PCR检测细胞中miR-190的表达

采用Trizol法提取A549细胞的总RNA后，使用紫外分光光度计检测RNA的浓度与纯度。再参照反转录试剂盒说明书步骤将RNA进行逆转录，将逆转录产物cDNA作为模板，根据上海生工生物合成的引物(miR-190 F:5’-GGGTGATATGTTTGATATATTAGG-3’,R:5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’;U6 F:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,R:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)按照PCR反应条件(94℃ 300s，94℃ 30s、58℃ 30s，共38个循环)进行PCR扩增。以U6作内参，2-ΔΔCt法计算A549细胞中miR-190的表达水平。重复3次。

四、MTT法检测细胞增殖

将指数期A549细胞以每孔3×104个接种至96孔细胞板上后，将其按照1.2中进行分组并转染。分别转染12 h、24 h、48 h和72 h后弃培养液，加入浓度为5g/L的MTT试剂20μL/孔，孵育4 h后，再加入二甲基亚砜震荡10 min。采用多功能酶标仪在492 nm波长处检测各组细胞的光密度值。重复3次。

五、Transwell小室实验检测细胞侵袭

胰蛋白酶消化收集转染48 h后的anti-miR-NC组、anti-miR-190组及未转染的Ctrl组细胞后，使用无血清的DMEM培养基制备浓度为105个/mL的细胞悬液。在铺于基质胶的Transwell小室的上室中加入细胞悬液300μL，同时下室中加入含血清的DMEM培养基800 μL，置于细胞培养箱中孵育24 h。使用磷酸缓冲液对取出的Transell小室洗涤后，以4%甲醛固定细胞25 min，再以0.1%结晶紫染色15 min。洗去染色液后，放于倒置显微镜下观察拍照并统计穿膜细胞数，结果以随机选取3个高倍视野(200×)内细胞数的均值表示。重复3次。

六、流式细胞仪检测细胞凋亡

收集转染48h后的anti-miR-NC组、anti-miR-190组及未转染的Ctrl组细胞，使用磷酸缓冲液洗涤后，加入500μL结合缓冲液重悬细胞。先后加入 Annexin-V-FITC和PI 各5 μL后，室温下避光反应10 min。使用流式细胞仪在60 min内检测各组细胞的凋亡率。重复3次。

七、双荧光素酶报告基因实验检测miR-190和GDF11的靶向关系

生物信息学软件预测发现GDF11 3’UTR区与miR-190存在互补的结合位点，将克隆扩增GDF11的3’UTR片段重组至psiCHECK-2荧光素酶载体上，作为GDF11野生型(GDF11-WT)报告基因载体；另外，将miR-190与GDF11 3’UTR结合的位点进行定点突变后重组至psiCHECK-2荧光素酶载体上，作为GDF11突变型(GDF11-MUT)报告基因载体。参照脂质体2000说明书步骤将构建的GDF11-WT和GDF11-MUT载体分别与miR-190模拟物/抑制剂、模拟物/抑制剂阴性对照共转染至A549细胞中，分别标记为GDF11-WT+miR-190/anti-miR-190组、GDF11-WT+miR-NC/anti-miR-NC组、GDF11-MUT+miR-190/anti-miR-190组、GDF11-MUT+miR-NC/anti-miR-NC组。转染48 h后参照荧光素酶检测试剂盒说明书检测各组细胞的荧光素酶活性。

八、免疫印迹法检测细胞中GDF11蛋白的表达

将指数期的A549细胞以每孔105个接种至6孔细胞板上后，置于细胞培养箱中常规培养。细胞分为miR-190模拟物(miR-190)组、模拟物阴性对照(miR-NC)组、anti-miR-190组和anti-miR-NC组，其中每组3个复孔。参照脂质体2000说明书步骤根据上述分组将miR-190模拟物/抑制剂及模拟物/抑制剂阴性对照转染至A549细胞中，转染48 h后胰蛋白酶消化收集各组细胞，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，并采用BCA法检测总蛋白的浓度。将蛋白样品与等体积上样缓冲液混匀后，在沸水浴中煮沸5 min。将变性后的蛋白样品加入到十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。待电泳结束后，转至聚偏二氟乙烯上。以5%脱脂奶粉封膜2 h后，加入1 ∶1 000比例稀释的GDF11和β-actin抗体并在4℃下孵育24 h。弃一抗后，再以1 ∶2 000比例稀释的二抗室温孵育1.5 h。经化学发光剂显影曝光后，以β-actin为内参，采用凝胶成像系统扫描分析各组细胞中GDF11蛋白的表达水平。重复3次。

九、数据分析

结 果

一、转染后肺癌A549细胞中miR-190表达

实时荧光定量PCR检测结果表1显示，在转染miR-190抑制剂阴性对照的anti-miR-NC组中miR-190的表达水平与Ctrl组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但在转染miR-190抑制剂的anti-miR-190组中miR-190的表达水平较Ctrl组明显降低(P<0.05)(见表1)。

表1 转染后各组细胞中miR-190表达水平

二、miR-190低表达对肺癌A549细胞增殖的影响

MTT法检测结果表2显示，转染12 h～72 h后anti-miR-NC组细胞的增殖活力与Ctrl组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但转染24 h～72 h后anti-miR-190组细胞的增殖活力较Ctrl组明显降低(P<0.05)(见表2)。

表2 转染不同时间后各组细胞光密度值的比较

三、miR-190低表达对肺癌A549细胞侵袭的影响

Transwell小室检测结果图1和表3所示，与Ctrl组比较，anti-miR-190组中侵袭细胞数明显减少(P<0.05)，但anti-miR-NC组与Ctrl组比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表3,图1)。

表3 各组中侵袭细胞数和细胞凋亡率的比较

图1 Transwell小室检测各组细胞侵袭结果(×200)

四、miR-190低表达对肺癌A549细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果图2和表3所示，anti-miR-NC组细胞凋亡率与Ctrl组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但anti-miR-190组细胞凋亡率较Ctrl组明显升高(P<0.05)(见表3,图2)。

图2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡结果

图3 miR-190和GDF11的关系分析

五、miR-190靶基因的预测及其验证

TargetScan生物学信息学软件预测结果图3A所示，GDF11 3′ UTR与miR-190存在互补的结合位点。双荧光素酶报告基因实验检测结果表4所示，与相应对照miR-NC和anti-miR-NC组比较，转染miR-190模拟物可明显降低GDF11-WT质粒转染的A549细胞荧光素酶活性，而转染miR-190抑制剂可明显升高其荧光素酶活性(P<0.05)；但转染miR-190模拟物或miR-190抑制剂后GDF11-MUT质粒转染的A549细胞的荧光素酶活性与相应对照比较差异无统计学意义(P>0.05)。同时，免疫印迹法检测结果图3B和表4所示，转染miR-190模拟物可明显抑制A549细胞中GDF11蛋白的表达，而转染miR-190抑制剂则明显促进GDF11蛋白的表达(P<0.05)(见表4，图3 A、B)。

表4 各组细胞荧光素酶活性和GDF11蛋白表达水平的比较

讨 论

肺癌是常见的呼吸系统肿瘤，由于其发病隐匿的特性，多数患者就诊时已为晚期，错失了根治性手术治疗的最佳时期，患者在5年内的生存率只有15%左右[1,11]。因此，深入探讨肺癌发生发展的分子机制寻找新的、有效的治疗靶点十分必要。

miR-190是一条高度保守的miRNA，位于15号染色体的talin2基因的内含子区域；其在不同肿瘤中呈现不同表达，且发挥着不同的作用。例如：miR-190在乳腺癌中表达下调，不仅可通过调控TGF-β诱导的上皮-间质转化在癌转移过程中发挥着抑制作用[12]，还可通过靶向Sry相关高泳动类非组蛋白基因9(Sry-related high mobility group-box gene 9，SOX9)抑制Wnt /β-连环蛋白(β-catenin)信号传导提高抗雌激素敏感性[13]；miR-190在胶质瘤中表达下调，且可通过调控细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡发挥抑癌作用[14]；然而，miR-190在肝癌中表达上调[15]，可通过靶向抑制PH结构域且富含亮氨酸重复基序的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶1(pleckstrin homology domain leucine-rich repeat protein phosphatase 1，PHLPP1)的表达在癌细胞增殖和转移过程中发挥着重要的促进作用[16]。尽管已有学者[9-10]指出，miR-190在肺癌中表达上调，但其发挥的作用并不清楚。本研究通过转染miR-190抑制剂成功下调miR-190表达后发现，肺癌A549细胞的增殖活力和侵袭能力明显减弱，同时细胞凋亡能力明显增强。结果表明，miR-190低表达可抑制肺癌A549细胞增殖、侵袭并促进细胞凋亡。这提示miR-190可通过调控细胞增殖、侵袭和凋亡参与肺癌的发生发展。

GDF11是转化生长因子β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)超家族成员，在胚胎正常发育过程中发挥着重要作用。研究显示，GDF11在肝癌和食管癌等中异常表达，且可通过调控细胞增殖、侵袭和凋亡等发挥着重要的抑癌作用[17-18]。已有研究[19-20]指出，GDF11低表达与肺癌患者的恶性程度高有关，且外源表达GDF11后可通过p53、葡萄糖转运因子1(glucose transporter type1，GLUT1)、 B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotease，MMP-2)等蛋白抑制细胞增殖、转移并促进细胞凋亡。本研究进一步对miR-190的靶基因进行预测，结合相关资料，最终将GDF11作为研究对象。生物信息学软件预测发现GDF11 3’UTR区域与miR-190存在互补的结合位点，同时采用双荧光素酶报告基因实验证实miR-190可与GDF11 3’UTR靶向结合；免疫印迹法进一步检测证实miR-190可负向调控GDF11蛋白的表达。结果表明，GDF11是miR-190的靶基因。这提示，miR-190调控肺癌细胞增殖、侵袭和凋亡可能与靶向调控GDF11表达有关。

总之，miR-190低表达可抑制肺癌A549细胞增殖与侵袭并促进细胞凋亡，其作用机制可能与靶向调控GDF11表达有关。该结果丰富了肺癌发生发展的分子机制，也为肺癌的治疗提供了新线索。